(重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 401121)

替加氟為抗腫瘤藥物，作用機(jī)理、療效及抗瘤譜與氟尿嘧啶相似，與氟尿嘧啶相比作用持久、吸收良好、毒性較低。替加氟栓臨床上主要用于結(jié)腸癌、直腸癌等疾病[1]，國(guó)外除日本藥局方第十六改正收載了替加氟原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)外，其他各國(guó)藥典均未收載。經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，替加氟栓現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中鑒別和含量測(cè)定的專屬性不強(qiáng)，不能有效區(qū)分替加氟及其主要雜質(zhì)氟尿嘧啶，且無(wú)有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)。在標(biāo)準(zhǔn)提高工作中，筆者著重對(duì)上述存在的問題進(jìn)行了考察，擬訂了高效液相色譜(HPLC)法鑒別和含量測(cè)定法，并增加了有關(guān)物質(zhì)檢查法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

替加氟對(duì)照品(批號(hào)為100468－200401，中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇、乙腈(色譜純)，試驗(yàn)用水(超純水);替加氟栓(國(guó)內(nèi)市售品，成都第一制藥有限公司，威海華新藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格為每枚 0.5 g，批號(hào)為 101001，100701)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

2.2 高效液相色譜鑒別

在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖(圖1)中，供試品溶液主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間一致。兩批供試品溶液主峰的保留時(shí)間均與對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間一致。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 有關(guān)物質(zhì)檢查

2.3.1 擬訂方法

精密稱取本品適量，加流動(dòng)相定量稀釋成每1 mL中約含0.2 mg的溶液作為供試品溶液;精密量取適量，用流動(dòng)相定量稀釋成每1 mL中含2 μg的溶液，作為對(duì)照溶液;另取氟尿嘧啶對(duì)照品，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋成每1 mL中約含1 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照高效液相色譜法[2]測(cè)定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇－乙腈－水(10∶5∶85)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為271 nm，理論板數(shù)按替加氟峰計(jì)算不低于1 500，替加氟峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。取對(duì)照溶液20 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%;再精密量取供試品溶液、對(duì)照溶液與對(duì)照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液色譜圖中，如出現(xiàn)與對(duì)照品溶液色譜圖中氟尿嘧啶保留時(shí)間一致的峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，其含量不得大于標(biāo)示量的0.5%，其他各雜質(zhì)峰面積之和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 0.5 倍(0.5%)。

2.3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

在該色譜條件下，替加氟與氟尿嘧啶在271 nm波長(zhǎng)處均有吸收，故選擇271 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.3 專屬性試驗(yàn)

酸破壞:取批號(hào)為101001的樣品約72 mg，置100 mL容量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液5 mL，置80℃水浴中加熱10 min，冷卻，加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

堿破壞:取批號(hào)為101001的樣品約72 mg，置100 mL容量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，置80℃水浴中加熱10 min，冷卻，加1 mol/L鹽酸溶液5 mL，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

氧化破壞:取批號(hào)為101001的樣品約72 mg，置100 mL容量瓶中，加30%過氧化氫溶液，置80℃水浴中加熱10 min，冷卻，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

高溫破壞:取批號(hào)為101001的樣品約72 mg，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，置80℃水浴中放置半小時(shí)，冷卻，作為供試品溶液。

1若寶寶燙傷較嚴(yán)重，除去衣服時(shí)，已有明顯的紅色滲水的創(chuàng)面（表皮已燙掉）就不要再用水沖洗，以免感染；也不要把冰塊直接放在傷口上降溫，以免皮膚組織凍傷。應(yīng)用慶大霉素加生理鹽水擦拭患處，用紗布嚴(yán)密包裹后，立即送醫(yī)院進(jìn)行治療。

光破壞:取批號(hào)為101001的樣品約72mg，置100mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，置日光下放置72h，作為供試品溶液。

取上述破壞后的供試品溶液，照擬訂的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖(見圖2)?？梢?，樣品經(jīng)破壞后產(chǎn)生的降解產(chǎn)物均能與替加氟和氟尿嘧啶峰有效分離，用二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，替加氟和氟尿嘧啶的純度均符合要求，說(shuō)明擬訂的色譜條件可用于測(cè)定替加氟片的有關(guān)物質(zhì)。

圖2 破壞試驗(yàn)高效液相色譜圖

2.3.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:取替加氟對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋制成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照溶液，進(jìn)樣20 μL測(cè)定?；貧w方程為A=50.062 C+9.217 8，r=1.000(n=5)。結(jié)果表明替加氟質(zhì)量濃度在 5.92 ～47.36 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

系統(tǒng)耐用性試驗(yàn):分別用菲羅門、安捷倫公司等不同品牌的色譜柱及Agilent 1100型、Waters 2695型不同型號(hào)的色譜儀，按擬訂的條件試驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果基本一致，說(shuō)明方法的耐用性較好。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取氟尿嘧啶對(duì)照品0.01149g，置100mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，精密量取20 mL，加流動(dòng)相稀釋至100 mL，搖勻，即得加樣對(duì)照品貯備液。精密稱取同一批樣品(成都第一制藥有限公司)20 mg，置100 mL容量瓶中，共9份，分別精密加入加樣對(duì)照品貯備液4，5，6 mL(各3份)，加甲流動(dòng)相稀釋至刻度，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按擬訂的色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 氟尿嘧啶加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.3.5 樣品檢測(cè)結(jié)果

樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果見表2?？梢?，兩批樣品中氟尿嘧啶雜質(zhì)含量小于標(biāo)示量的0.5%，其他雜質(zhì)峰面積總和低于規(guī)定的限度。因此，將替加氟栓的有關(guān)物質(zhì)限度規(guī)定為氟尿嘧啶雜質(zhì)含量不得過0.5%，總雜質(zhì)不得過0.5%。

表2 樣品有關(guān)物質(zhì)及含量測(cè)定結(jié)果

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 擬訂方法

含量測(cè)定:照高效液相色譜法(附錄V D)測(cè)定[2]。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇－乙腈－水(10∶5∶85)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為271 nm。理論板數(shù)按替加氟計(jì)算不低于1 500，替加氟峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。

測(cè)定法:取本品10粒，精密稱定適量(約相當(dāng)于替加氟50 mg)，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相適量，溫?zé)幔駬u使替加氟溶解，冷卻，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液適量，用流動(dòng)相定量稀釋成每1 mL中約含20 μg的供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖;另取替加氟對(duì)照品，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1 mL約含20 μg的對(duì)照品溶液，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

2.4.2 方法學(xué)考察

重復(fù)性試驗(yàn):取批號(hào)為101001的樣品，精密量取6份，照擬訂的方法測(cè)定。結(jié)果替加氟含量分別為標(biāo)示量的 95.7%，94.2% ，94.3% ，95.8% ，95.6% ，95.6% ，平均 95.2% ，RSD=0.78%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性好。

精密度試驗(yàn):取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針。結(jié)果替加氟峰面積分別為 1 216，1 214，1 214，1 225，1 210，RSD=0.46%(n=6)，表明儀器精密度良好。

定量限及檢測(cè)限確定:精密稱取替加氟對(duì)照品0.010 93 g，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解后，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻;精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻;精密量取1 μL 進(jìn)樣。結(jié)果檢測(cè)限為 0.001 μg/mL，定量限為 0.004 μg/mL。

線性關(guān)系考察:同有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于配制后 0，1，2，4，6，8 h時(shí)依法進(jìn)樣。結(jié)果替加氟峰面積分別為1 216，1 207，1 201，1 198，1 199，1 188，RSD=0.78%(n=6)，表明供試品溶液在 8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取替加氟對(duì)照品0.195 0 g，置100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得加樣對(duì)照品貯備液。精密稱取樣品10 mg，置50 mL容量瓶中(共9份)，分別精密加入加樣對(duì)照品貯備液4，5，6 mL(各3份)，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密稱取替加氟對(duì)照品0.011 84 g，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。精密量取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

2.4.3 樣品含量測(cè)定

按擬訂的含量測(cè)定方法測(cè)定樣品含量，并與現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中紫外分光光度(UV)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見表2。根據(jù)樣品實(shí)際測(cè)定結(jié)果，含量限度仍定為“本品含替加氟(C8H9FN2O3)應(yīng)為標(biāo)示量的 90.0% ～110.0%”。

表3 替加氟含量測(cè)定加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

3 討論

替加氟栓現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，鑒別和含量測(cè)定均采用UV法。由于替加氟與其主要雜質(zhì)氟脲嘧啶紫外光譜相似，UV法不能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，而采用高效液相色譜法能有效分離并測(cè)定氟脲嘧啶和其他有關(guān)物質(zhì)。

現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)用UV法測(cè)定替加氟含量時(shí)，栓劑基質(zhì)和氟尿嘧啶會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響。HPLC法能將替加氟與基質(zhì)、雜質(zhì)峰有效分離，測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。

[1]WS－10001－(HD－0162)－2002，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)·化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(第二冊(cè))[S].

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅤD.