陳興田 陳廣通 汪冬庚 黃金華

[摘要]目的觀察復(fù)方金蟾膠囊對(duì)小鼠移植性肝癌HepA腹水瘤的抑制作用。方法將50只BALB/C小鼠隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組（環(huán)磷酰胺，CTX）、金蟾小劑量組、金蟾中劑量組和金蟾大劑量組，每組10只。采用移植性HepA肝癌腹水瘤模型，進(jìn)行抑制腫瘤的實(shí)驗(yàn)；給藥結(jié)束第3天，摘取小鼠腫瘤組織和胸腺組織計(jì)算抑瘤率和胸腺指數(shù)，用流式細(xì)胞儀觀察腫瘤細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況；取血測(cè)定血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。結(jié)果與模型組比較，金蟾各劑量組均可以增加小鼠胸腺重量及胸腺指數(shù)（P<0.01），明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)；與模型組比較，對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞僅G2/M期比例增加（P<0.05），金蟾小劑量組僅S期細(xì)胞比例增高（P<0.05）；金蟾大劑量組G2/M期、S期細(xì)胞比例均高于模型組。結(jié)論復(fù)方金蟾膠囊對(duì)小鼠移植性HepA肝癌腹水瘤具有明顯抑制作用。

[關(guān)鍵詞]肝癌；BALB/C小鼠；環(huán)磷酰胺；金蟾膠囊

[中圖分類號(hào)]R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1674-4721（2012）12（a）-0012-03

隨著工業(yè)化的進(jìn)展的加速，各種污染就隨之而來(lái)，癌癥的發(fā)生率也逐步上升。在長(zhǎng)江和黃海的交界的啟海農(nóng)村，肝癌成為最常見的惡性腫瘤。為此，國(guó)家專門設(shè)立江蘇省啟東肝癌研究所，以研究肝癌的起因、預(yù)防和治療。目前治療肝癌的方法很多，效果均不明顯，尤其是晚期肝癌，生存期很難延長(zhǎng)。開發(fā)傳統(tǒng)中草藥用來(lái)抗癌是當(dāng)今腫瘤防治的趨勢(shì)之一。蟾蜍是指兩棲綱蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍，多產(chǎn)于江浙一帶，以蟾蜍為來(lái)源的中藥材有蟾酥、蟾皮、干蟾，主要藥用作用有強(qiáng)心、解毒、止痛、增強(qiáng)免疫等。其本身就有一定毒性，食用過(guò)量會(huì)導(dǎo)致死亡。所以，古代中醫(yī)就有“以毒攻毒”的說(shuō)法，用它來(lái)治療惡性疾病。目前發(fā)現(xiàn)蟾蜍具有一定抗腫瘤的作用，啟東肝癌研究所生產(chǎn)的復(fù)方蟾龍片，海門的蟾衣研究所生產(chǎn)的蟾衣制品，均為開發(fā)的蟾蜍產(chǎn)品，在臨床抗肝癌治療中，都取得了一定的效果。金蟾膠囊是本院自行開發(fā)研制，以中華大蟾蜍的新鮮蟾皮為主藥，配以其他十幾味珍貴中藥精制而成的中藥復(fù)方制劑。本研究復(fù)制肝癌模型，施以金蟾膠囊治療，觀察驗(yàn)證其抗腫瘤作用并探討其作用機(jī)制，為該復(fù)方中藥的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

BALB/C小鼠50只，均為雄性，體重20～25g，由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2002—0022。瘤株采用HepA肝癌腹水瘤小白鼠，種鼠由中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所提供。

1.2儀器與試藥

1.2.1儀器 流式細(xì)胞儀：美國(guó)guavaeasyCyte8系統(tǒng)；分析天平：梅特勒-托利多-30型；凈化臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備公司SW-CJ-2F型。

1.2.2試藥 金蟾膠囊：每粒含中藥0.25g，由南通大學(xué)藥學(xué)院加工制備，批號(hào)：20110408；實(shí)驗(yàn)前將膠囊內(nèi)容物用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC）水溶液調(diào)配成3種不同濃度的混懸液，備用。環(huán)磷酰胺（CTX）：無(wú)錫恒瑞制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：110211，實(shí)驗(yàn)時(shí)用注射用蒸餾水溶解配制。

1.3方法

取出HepA肝癌腹水瘤小白鼠的腹水瘤，搗碎成溶液。吸取0.2mL用16號(hào)針尖腹腔接種到BALB/C小鼠的腹內(nèi)，一共接種50只，第2天稱重，隨機(jī)分為5組。（1）模型對(duì)照組：10只小鼠，用0.5%CMC溶液灌胃，劑量為1mL/100g小白鼠體重；（2）陽(yáng)性對(duì)照組：10只小鼠，腹腔注射CTX，劑量為2mg/100g體重；（3）金蟾小劑量組：10只小鼠，用金蟾膠囊混懸液灌胃，劑量為40mg/100g體重；（4）金蟾中劑量組：10只小鼠，用金蟾膠囊混懸液灌胃，劑量為80mg/100g體重；（5）金蟾大劑量組：10只小鼠，用復(fù)方金蟾膠囊混懸液灌胃，劑量為120mg/100g。各組按照上述要求給藥，每天1次，連續(xù)10d，到第11天處死。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1抑瘤率和胸腺指數(shù) 剝離皮下瘤塊，用濾紙吸干凈后稱重，計(jì)算各組抑瘤率和胸腺指數(shù)。計(jì)算公式為胸腺指數(shù)=[胸腺質(zhì)量（mg）/小鼠質(zhì)量（g）]×10。抑瘤率=（對(duì)照組平均瘤重－治療組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重[1-2]。

1.4.2小鼠TNF-a濃度測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)到第11天小鼠處死前，各組采用眼球摘取法取血1mL，放置于冰箱0℃保存，24h后，于1500r/min離15min，取上清液，用波長(zhǎng)450nm酶聯(lián)儀依序測(cè)量光密度（OD值）后換算血清中TNF-α濃度[3-4]。

1.4.3金蟾膠囊對(duì)HepA肝癌腹水瘤細(xì)胞周期測(cè)定 各組小鼠處死后，立即打開腹部，剝離腹部腫瘤組織，放入少許磷酸鹽緩沖液，將腫瘤組織用手術(shù)剪剪至漿糊狀，再用200目尼龍篩過(guò)濾。然后將濾液用緩沖液PBS沖洗3次，沖完后用600r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，除去大的細(xì)胞碎片。每根試管中加入70%乙醇1mL，用于固定細(xì)胞，然后放置于低溫冰箱-20℃凍存，24h后溶解，離心去除乙醇，再用緩沖液PBS沖洗2次。加入混合溶液1mL（含0.1%檸檬酸三鈉、0.3%TritonX-100、RNA酶、0.002%、0.01%PI，用0.9%氯化鈉溶液配制），10min后用200目尼龍篩過(guò)濾，取濾液上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期[5-7]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Stata7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析 各組資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組的抑瘤率和胸腺指數(shù)比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，與模型對(duì)照組比較，復(fù)方金蟾膠囊各組小鼠平均腫瘤組織的重量均有明顯降低，其中，大劑量組與其他兩組比較，對(duì)HepA肝癌腹水瘤有更顯著的抑制作用（P<0.01），胸腺指數(shù)也顯著增高（P<0.01），并隨著劑量的遞增，抑瘤作用逐漸增強(qiáng)，顯示出有較好的量-效關(guān)系。見表1。

2.2血清TNF-α濃度的測(cè)定

與模型對(duì)照組之間比較，3個(gè)藥物治療組的血清TNF-α濃度均明顯降低（P<0.05）；而各治療組之間互相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見表2。

2.3金蟾膠囊對(duì)瘤細(xì)胞分裂各期的影響

復(fù)方金蟾膠囊各劑量組均能提高腫瘤細(xì)胞G0～G1期比例，減小S期比例，進(jìn)而促進(jìn)瘤細(xì)胞凋亡，其作用強(qiáng)度的變化呈劑量依賴性。金蟾膠囊各組對(duì)腫瘤細(xì)胞G2～M期的影響不大。結(jié)果見表3。

3討論

復(fù)方金蟾膠囊是由蟾皮、東北虎骨草、藏雪蓮、蝎子等珍貴中藥精致提煉而成。為驗(yàn)證其臨床抗癌效果，本研究通過(guò)復(fù)制移植HepA肝癌腹水瘤小鼠的建立模型，進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，復(fù)方金蟾膠囊對(duì)HepA肝癌腹水瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，并呈劑量依賴性，其可能在誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、改變腫瘤細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)等方面發(fā)揮抗腫瘤的作用。

血清中的TNF-α能嚴(yán)重破壞細(xì)胞因子間正向的協(xié)調(diào)作用，使細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)功能紊亂，造成血管滲漏、脂肪降解等病理?yè)p傷。而在實(shí)體瘤小鼠體內(nèi)的TNF-α?xí)惓Ｉ遊8-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：金蟾膠囊能顯著降低HepA肝癌腹水瘤小鼠TNF-α濃度，增加小鼠胸腺重量及胸腺指數(shù)，對(duì)于TNF-α水平異常升高的HepA肝癌腹水瘤小鼠起到明顯的抑制作用，并控制在一個(gè)低水平狀態(tài)，說(shuō)明其是通過(guò)提高機(jī)體免疫作用來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤療效的。

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠HepA肝癌腹水瘤的細(xì)胞周期各時(shí)相分布，發(fā)現(xiàn)在復(fù)方金蟾膠囊的藥物作用下的小鼠肝癌H22細(xì)胞細(xì)胞周期時(shí)相發(fā)生變化，使細(xì)胞增殖周期受阻，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；其S期細(xì)胞百分比明顯減少，差異極顯著；表明復(fù)方金蟾膠囊能明顯阻滯肝癌H22細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，使其停滯于G1/G0期，從而減少細(xì)胞在該期DNA的復(fù)制和合成，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。

總之，金蟾膠囊抗腫瘤作用確切，可以進(jìn)一步研究開發(fā)利用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 顧錦華，張偉，李鋒，等.復(fù)方龍葵膠囊抗腫瘤作用及其對(duì)腫瘤細(xì)胞周期分布的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（12）：2463-2464.

[2] 趙明芳，劉云鵬，侯科佐，等.蟾蜍毒素對(duì)Ｓ180小鼠移植瘤的抑制作用及其毒副作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].山西醫(yī)藥雜志，2006，35（3）：189-191.

[3] 崔智.華蟾素注射液聯(lián)合化療對(duì)小鼠原位移植H22肝癌的影響[J].河北醫(yī)藥，2010，32（18）：2489-2491.

[4] 金瑩，孫愛東.蘋果多酚對(duì)小鼠H22細(xì)胞株移植性腫瘤的抑制作用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，30（24）：23-25.

[5] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局.中藥新藥研究指導(dǎo)原則[S].1994：85-89.

[6] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥新藥研究的技術(shù)要求[S].1999：116-119.

[7] 徐叔云，卞如濂，陳修，等.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：757.

[8] 訾華浦，陳紅，呂紅英，等.西松烷型二萜對(duì)小鼠H22肝癌腹水瘤的抑制作用及其機(jī)制[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25（4）：16-18.

[9] 李彬彬，王瑩，趙金茹，等.小柴胡湯聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)腹水瘤細(xì)胞株肝癌小鼠腫瘤間質(zhì)血管生成影響隨機(jī)平行對(duì)照研究[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2012，38（10）：135-136.

[10] 鄭艷花，王琳，姜子瑜，等.腹腔內(nèi)連續(xù)或間斷應(yīng)用重組人血管內(nèi)皮抑素治療H22腹水瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2012，38（3）：20-21.

[11] 王鴻梅.TNP-470對(duì)小鼠肝癌H22腹水瘤的治療研究[J].腫瘤研究與臨床，2006，30（4）：1315-1317.

[12] 李秀華，張陽(yáng).TNP-470對(duì)小鼠腹水瘤腹水生成的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，19（1）：17-19.

（收稿日期：2012-09-13 本文編輯：陳 俊）