毛鎮(zhèn)偉 滿昌峰 彭輝勇 范鈺
[摘要]目的觀察欖香烯乳對人大腸癌細胞遷移、侵襲的影響,并探討其可能機制。方法采用不同濃度的欖香烯乳處理人大腸癌HCT116細胞后,以劃痕試驗方法檢測癌細胞遷移能力,以Transwell方法檢測癌細胞侵襲能力,采用熒光實時定量PCR方法檢測癌細胞miR-155mRNA水平。結(jié)果人大腸癌HCT116細胞經(jīng)欖香烯乳處理后,遷移和侵襲力均明顯下降,且呈劑量依賴性(P<0.05)。欖香烯乳處理組miR-155mRNA水平明顯下調(diào),且呈濃度依賴性。結(jié)論欖香烯乳可降低人大腸癌細胞侵襲能力,下調(diào)miR-155mRNA表達是其重要機制之一。
[關鍵詞]大腸腫瘤;欖香烯乳;侵襲力;miR-155
[中圖分類號]R735.3+4 [文獻標識碼]A [文章編號]1674-4721(2012)12(a)-0007-03
近年來,國內(nèi)大腸癌發(fā)病率逐漸增高,尋找有效的治療藥物和治療手段乃當務之急。欖香烯乳(elemene)是從中藥溫莪術提取的有效成分之一,臨床應用已顯示其具有較廣泛的抗癌譜[1-5]。但是欖香烯乳調(diào)控癌細胞侵襲的分子機制尚不完全清楚。本課題組以大腸癌HCT-116細胞為模型,探討了欖香烯乳對癌細胞遷移、侵襲的效應,并從microRNA(miRNA)角度探討其分子機制。
1材料與方法
1.1實驗材料
欖香烯乳,購自華立金港制藥有限公司;人大腸癌細胞系HCT-116,本院組織細胞生物庫凍存;RNA提取試劑TriIzol購自美國Invitrogen公司;基底膜膠(Matrigel)購自BD公司;RPMI1640、胎牛血清均購自Gibco公司。
1.2實驗方法
1.2.1細胞培養(yǎng)及藥物處理 人大腸癌HCT-116細胞置于含5%胎牛血清的RPMI-1640液中,在37°CCO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞至對數(shù)生長期,采用不同濃度(10、20、40μg/mL)的欖香烯乳處理,以RPMI-1640代替欖香烯乳處理細胞作為空白對照組,3復孔,備測。
1.2.2癌細胞遷移檢測 采用劃痕法檢測癌細胞遷移能力,具體步驟參照文獻[6]方法進行?;静僮鞑襟E如下:(1)先用marker筆在6孔板背后,用直尺比著,均勻地劃橫線,大約每隔0.5~1.0cm一道,橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。(2)同樣方法培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期,消化、計數(shù),使用培養(yǎng)基配制成濃度為8×105個/mL的細胞懸液,6孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入1mL細胞懸液,放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至細胞鋪滿單層。(3)用100μL槍頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃痕;用槍頭比著直尺,盡量垂直于背后的橫線劃痕,槍頭要垂直,不能傾斜。(4)棄去培養(yǎng)基,用PBS洗細胞3次,去除劃下的細胞,用培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度,每孔加入1000μL相應的含藥培養(yǎng)基,同時設立陰性對照組。(5)6孔細胞培養(yǎng)板置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,拍照。
1.2.3細胞侵襲檢測 該試驗在Transwell板上進行,具體步驟參照文獻[7-8]方法進行。倒置顯微鏡(×100)觀察穿過膜的細胞數(shù)。每張膜中央部分和周圍部分各隨機取3個視野,計數(shù)每個視野內(nèi)穿過聚碳酸酯膜微孔的細胞數(shù)。
1.2.4miR-155mRNA水平檢測 采用熒光實時定量PCR檢測。采用Trizol方法抽提細胞總RNA抽提,采用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-155定量PCR上游引物:5′-CGCGCTTAATGCTAATCGTGA-3′;下游引物:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,大小為62bp。內(nèi)參GAPDH上游引物:5-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3′;下游引物:5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3′,大小為115bp。循環(huán)條件及計算方法參照文獻[9]進行。
1.3統(tǒng)計學方法
采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理,所得到的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2結(jié)果
2.1欖香烯乳對大腸癌細胞遷移的影響
采用劃痕法觀察欖香烯乳對癌細胞遷移的影響。與對照組癌細胞(圖1A)比較,欖香烯乳處理組癌細胞遷移速度較慢,遷移距離明顯低于空白對照組(圖1B),后者劃痕兩側(cè)癌細胞已趨融合。
2.2欖香烯乳對大腸癌細胞侵襲的影響
收集經(jīng)欖香烯乳處理的HCT116細胞,采用Transwell檢測癌細胞侵襲情況。對照組、不同濃度(10、20、40μmol/L)欖香烯乳處理組穿過濾膜的細胞分別為(43.8±1.7)、(31.6±1.6)、(18.5±1.5)和(8.8±1.2)個。統(tǒng)計學分析提示,細胞侵襲呈濃度依賴性減少(P<0.05)。
2.3欖香烯乳對大腸癌細胞miR-155的影響
以欖香烯乳處理大腸癌HCT-116細胞后,采用熒光實時定量CR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,欖香烯乳各處理組miR-155mRNA水平明顯下調(diào),呈濃度依賴性(P<0.05)。見圖2。
3討論
遷移性是轉(zhuǎn)移性癌細胞重要特征之一。在成體組織中大多數(shù)正常細胞不具有遷移性,而惡性腫瘤細胞一般具有十分活躍的遷移性。體外培養(yǎng)時,正常細胞具有遷移的接觸抑制,因而呈單層生長;而癌細胞喪失了遷移的接觸抑制,從而呈多層重疊生長。本研究發(fā)現(xiàn),大腸癌HCT-116細胞具有較強的遷移性,而經(jīng)欖香烯乳處理后,細胞遷移距離明顯縮短。
惡性腫瘤的主要生物學特性是侵襲和轉(zhuǎn)移,而這也是惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一。腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過程非常復雜,盡管不同種類腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移特性有所不同,但侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的關鏈步驟基本相同。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移過程首先包括腫瘤細胞的分離脫落(即惡性腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤病灶脫離),然后向周圍組織侵襲,當腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤分離脫落后,必須穿透原發(fā)腫瘤周圍的宿主結(jié)締組織才能進入循環(huán)系統(tǒng),之后通過血液循環(huán)和淋巴循環(huán)游走到遠處組織器官,形成繼發(fā)性腫瘤。在此過程中,腫瘤細胞侵襲細胞外基質(zhì)是重要的步驟。在本研究體外侵襲實驗中,觀察到人大腸癌HCT-116細胞具有較強的侵襲能力,經(jīng)欖香烯乳處理后,癌細胞侵襲能力明顯下降,且呈濃度依賴性(P<0.05)。由此說明,欖香烯乳對大癌細胞侵襲具有明顯的抑制作用。
MicroRNAs是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的長為20~24nt單鏈小分子RNA。大量證據(jù)表明,microRNAs的異常表達與多種人類癌癥的發(fā)生密切相關[10]。MicroRNAs的發(fā)現(xiàn)和應用為惡性腫瘤的診斷和治療提供了新的靶點。實驗研究表明,miR-155過表達和多種上皮系統(tǒng)來源惡性腫瘤的發(fā)生及其惡性生物學表型密切相關。在許多實體瘤如乳腺癌、大腸癌等多種實體瘤組織或細胞中高表達[11-12],但目前尚不清楚miR-155在大腸癌細胞侵襲中的可能作用。本研究以欖香烯乳處理大腸癌細胞后,以蛋白質(zhì)印跡方法檢測MK基因蛋白水平,結(jié)果顯示,欖香烯乳各處理組miR-155水平明顯下調(diào),且呈濃度依賴性(P<0.05)。因此,筆者推測欖香烯乳抑制大腸癌細胞遷移侵襲,可能與下調(diào)miR-155mRNA有關。
本研究結(jié)果提示,欖香烯乳可明顯降低大腸癌細胞侵襲能力,下調(diào)miR-155表達是其重要機制之一。
[參考文獻]
[1] WangG,LiX,HuangF,etal.Antitumoreffectofbeta-elemeneinnon-small-celllungcancercellsismediatedviainductionofcellcyclearrestandapoptoticcelldeath[J].CellMolLifeSci,2005,62(7-8):881-893.
[2] ZhaoJ,LiQQ,ZouB,etal.Invitrocombinationcharacterizationofthenewanticancerplantdrugbeta-elemenewithtaxanesagainsthumanlungcarcinoma[J].IntJOncol,2007,31(2):241-252.
[3] LiQQ,WangG,HuangF,etal.Antineoplasticeffectofbeta-elemeneonprostatecancercellsandothertypesofsolidtumourcells[J].JPharmPharmacol,2010,62(8):1018-1027.
[4] LeeRX,LiQQ,ReedE.β-elemeneeffectivelysuppressesthegrowthandsurvivalofbothplatinum-sensitiveandresistantovariantumorcells[J].AnticancerRes,2012,32(8):3103-3113.
[5] 范鈺,張尤歷,李華.欖香烯乳對胃癌細胞人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶及其啟動子的影響[J].江蘇大學學報醫(yī)學版,2006,16(5):413-415.
[6] FanY,ZhangYL,WuY,etal.Inhibitionofsignaltransducerandactivatoroftranscription3expressionbyRNAinterferencesuppressesinvasionthroughinducinganoikisinhumancoloncancercells[J].WorldJGastroenterol,2008,14(3):428-434.
[7] 詹洪峰,周永靜,張焱,等.RNAi下調(diào)TROP2基因?qū)ξ赴┘毎じ?、遷移和侵襲的影響[J].中華實驗外科雜志,2010,27(9):1272-1274.
[8] 范鈺,吳鶯,徐軍.沉默畸胎瘤衍生生長因子-1基因?qū)σ认侔┘毎關ANC1侵襲力的影響[J].中華胰腺病雜志,2010,10(3):199-201.
[9] 范鈺,鄭樹,丁佳逸.脂質(zhì)體介導的cripto反義寡核苷酸抑制結(jié)腸癌細胞端粒酶活性[J].中國病理生理雜志,2006,22(4):761-765.
[10] TricoliJV,JacobsonJW.MicroRNA:potentialforcancerdetection,diagnosis,andprognosis[J].CancerRes,2007,67(10):4553-4555.
[11] MattiskeS,SuetaniRJ,NeilsenPM,etal.TheoncogenicroleofmiR-155inbreastcancer[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2012,21(8):1236-1243.
[12] BakirtziK,HatziapostolouM,KaragiannidesI,etal.NeurotensinsignalingactivatesmicroRNAs-21and-155andAkt,promotestumorgrowthinmice,andisincreasedinhumancolontumors[J].Gastroenterology,2011,141(5):1749-1761.
(收稿日期:2012-10-18 本文編輯:陳 ?。?/p>