鮑方宇，張 敏,2,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100037)

薄層色譜法測定油脂中甘油三酯含量

鮑方宇1，張 敏1,2,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100037)

采用薄層色譜-可見分光光度法以內(nèi)標(biāo)法定量測定油脂中甘油三酯的含量。應(yīng)用硅膠柱層析將混合甘油酯中的甘油三酯分離出來，得到甘油三酯的高純品，作為甘油三酯測定的標(biāo)準(zhǔn)品。混合甘油酯經(jīng)薄層色譜分離、洗脫及顯色，然后經(jīng)分光光度法在700nm測定其吸光度，測定甘油三酯的含量。本方法的平均回收率為99.8%，有良好的準(zhǔn)確度，精密度略低；獲得的甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品，在10～100μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；保證薄層板在5min固定時間顯色，洗脫液在1.5h內(nèi)檢測，其穩(wěn)定性良好；樣品的檢測限為0.55μg/mL。本方法為混合脂肪酸組成的甘油三酯含量測定提供簡單快捷的方法。

薄層色譜-可見分光光度法；混合甘油酯；甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品

甘油酯的定量分析方法主要為外標(biāo)法，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線從而確定其含量[1-5]。此方法對于單一脂肪酸組成的甘油酯的分析十分準(zhǔn)確，但對于混合脂肪酸組成的甘油酯的含量測定存在一定的誤差。以大豆油為例，大豆油中的甘油酯為混合物，若使用單一脂肪酸組成的甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，會使甘油酯的含量偏低。由于各種植物油甘油三酯的種類和比例有自身的特點(diǎn)，最好的甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)是從原料本身制備出來的。這種制備的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的甘油三酯的種類是一致的，能夠很好的反應(yīng)樣品中的甘油三酯組成。它遠(yuǎn)比一兩個商業(yè)化的甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)樣更具有代表性，且測定更加準(zhǔn)確[6]。

薄層色譜法是一種微量分離方法[7]，是分離中性脂類(包括甘油三酯、二酯、單酯、游離脂肪酸、甾醇及酯)最簡單而且常用的方法[8]。薄層色譜法原理是動相溶劑帶動混合物組分流經(jīng)靜相的過程，使被分離組分在動相與靜相間進(jìn)行分配，是利用物質(zhì)的極性進(jìn)行吸附解吸最終分離物質(zhì)的方法，將混合甘油酯分離成不同的區(qū)域，每個區(qū)域為同一類物質(zhì)[9]。薄層色譜洗脫法聯(lián)合紫外-可見分光光度法在一些中藥成分及蘇丹紅的檢測中已有應(yīng)用，檢測方法成本低、操作簡單、分離效率高、易于普及[10-12]。薄層色譜可用于“可疑”樣本和很容易損壞高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)系統(tǒng)的樣本分析，這一優(yōu)點(diǎn)尤為重要[13]。

磷鉬酸是一種非特異性的物質(zhì)，可以檢測油脂中所有分離組分，分離物質(zhì)的區(qū)域和背景板比較具有較高的對比度，并可長時間保持其強(qiáng)度，歐洲藥典應(yīng)用其作為油脂定性檢測的試劑[14]。本研究采用磷鉬酸作為顯色劑，硅膠柱層析方法分離混合甘油酯得到甘油三酯的高純品作為標(biāo)準(zhǔn)品，薄層色譜洗脫與可見分光光度相結(jié)合，采用內(nèi)標(biāo)法定量測定油脂中甘油三酯含量，以期探索這種方法的可行性，為今后油脂中甘三酯含量的檢測提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

單槽層析缸(200mm×200mm) 天津思利達(dá)科技有限公司；層析板(200mm×200mm)；層析柱(Ф2.5cm×75cm、Ф1.2cm×100cm)；鋪板器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SC-3614低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；KQ-300E超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；XK96-A混勻器 姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；722S分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

硅膠G 青島海洋化工廠；一級大豆油(市售)；自制不同含量甘油三酯樣品；其他所用試劑均為分析純。1.2 檢測程序

薄層色譜板的制備，使用硅膠27g加5%羧甲基纖維素鈉81g研磨均勻鋪板，樣品用氯仿-甲醇(2:1，V/V)溶液溶解，展開劑為正己烷-乙醚-冰乙酸(45:25:1，V/V)[15]。樣品上行展開，自然晾干后，置碘蒸汽中顯色至斑點(diǎn)完全顯現(xiàn)，用10%磷鉬酸乙醇溶液將顯色的點(diǎn)完全覆蓋，置105℃烘箱中至斑點(diǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色為止，用濃氨水熏以去除背景影響。

將薄層上洗脫的斑點(diǎn)取下，加3mL蒸餾水溶解，4500r/min離心10min取上清液，定容至5mL，在(700±1)nm波長處測定其吸光度[16]。

另本實驗數(shù)據(jù)置信區(qū)間不小于95%，平行測定數(shù)據(jù)誤差范圍為±0.05，每塊薄層板分析6個樣品，每塊薄層板均進(jìn)行空白對照。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品制備流程圖Fig.1 Flow chart of standard sample preparation

標(biāo)準(zhǔn)品制備的流程如圖1所示。以一級大豆油為原料，在無溶劑體系采用脂肪酶催化甘油解反應(yīng)制備混合甘油酯。反應(yīng)條件為甘油/油物質(zhì)的量比為2:1(mol/mol)，甘油與硅膠質(zhì)量比為1:1，甘油含水量為1%，加酶量為(以反應(yīng)油脂質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn))10%，在45℃條件下反應(yīng)12h[17]。應(yīng)用碳酸鈉溶液脫除其中的游離脂肪酸，分子篩脫水[18]。

混合甘油酯采用柱層析法進(jìn)行分離，得到混合脂肪酸的甘油三酯。取15g樣品于100mL燒杯中，加入15mL氯仿溶解，溶液上硅膠柱(Ф2.5cm×75cm)，以200mL苯為洗脫劑進(jìn)行初步分離，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶得到甘油三酯的粗品[19]。取1g甘油三酯粗品溶解在20mL的正己烷中，然后溶液上硅膠柱(Ф1.2cm×100cm)，用250mL正己烷進(jìn)行梯度洗脫[6]，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶，吹氮去除溶劑殘留，經(jīng)0.45μm濾膜去除不溶性雜質(zhì)，得甘油三酯高純品。

獲得的高純品，經(jīng)薄層板鑒定后，做為甘油三酯的標(biāo)準(zhǔn)品使用。

1.4 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)值的計算

相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD[20]能夠指示數(shù)據(jù)之間的離散程度，用以指示數(shù)據(jù)的精密度和準(zhǔn)確度，計算公式如下：

式中：S為樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差，x 為樣本平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定

將大豆油按1.3節(jié)標(biāo)準(zhǔn)品制備方法分離，得到甘油三酯的高純品，作為甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品。獲得的大豆甘油三酯高純品經(jīng)薄層色譜鑒定結(jié)果如圖2所示。

圖2 薄層色譜鑒定圖Fig.2 TLC identification of triglyceride standard

圖2中從左至右依次為甘油三酯高純品、原料大豆油及混合甘油酯。薄層色譜圖中各物質(zhì)確定是根據(jù)其不同的Rf(遷移率)值確定的，甘油三酯、游離脂肪酸、1,3-甘油二酯、1,2-甘油二酯及單甘酯的極性是依次增大的，故其在薄層板上移動的距離依次減小，從而確定各物質(zhì)的成分[21]。大豆油中含有4種組分，從上至下依次為甘油三酯、游離脂肪酸、1,3-甘油二酯和1,2-甘油二酯，其中1,3-甘油二酯、1,2-甘油二酯含量較低；混合甘油酯中有5種成分，從上至下依次為甘油三酯、游離脂肪酸、1,3-甘油二酯、1,2-甘油二酯及單甘酯。比較大豆油和混合甘油酯的圖譜發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酶促反應(yīng)后，混合甘油酯中甘油二酯的含量明顯提高了，并且生成了單甘酯。

圖中甘油三酯高純品經(jīng)薄層色譜鑒定為一點(diǎn)，由于其他甘油酯在薄層板上的檢測限為0.5%[13]，說明甘油三酯已有較高的純度，可以作為標(biāo)準(zhǔn)品。采用內(nèi)標(biāo)法定量，分離出混合脂肪酸的甘油三酯高純品作為標(biāo)樣，避免了采用單一脂肪酸甘油三酯所造成的偏差。

2.2 甘油三酯線性范圍確定

將制得的甘油三酯高純品配制成不同質(zhì)量濃度的一系列溶液，各取2μL點(diǎn)于同一薄層板上。按實驗方法中的條件展開、顯色、洗脫，測定吸光度。以溶液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制甘油三酯與吸光度的關(guān)系曲線。結(jié)果可知，甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品含量在10～100μg/mL范圍之間，甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與吸光度之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.008X+0.0961，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9973。

2.3 穩(wěn)定性實驗

取樣品點(diǎn)樣，按色譜的檢測程序進(jìn)行展開、顯色、洗脫后測定吸光度，分別在1、1.5、2、2.5、3h和48h進(jìn)行檢測，測量結(jié)果如表1所示。

表1 穩(wěn)定性測量結(jié)果Table 1ble1 Stability of the developed method

從表1可以看出，洗脫后樣品在1.5h之內(nèi)吸光度穩(wěn)定。隨時間的推移吸光度逐漸降低，48h時測定的吸光度與空白樣的吸光度接近，故應(yīng)保證在1.5h內(nèi)檢測洗脫樣品。本方法采用磷鉬酸作為顯示劑，其對甘油三酯有良好的特異性，且顯色后產(chǎn)生的物質(zhì)穩(wěn)定，有利于操作人員的操作。

2.4 精密度實驗

2.4.1 平行性實驗

配制同一質(zhì)量濃度的樣品6份，在同一薄層板上以相同的條件展開、顯色、洗脫后測定吸光度，得吸光度如表2所示。

表2 平行性測定結(jié)果( =3)Table2 Results of parallel determinations ( =3)

從表2可知，同濃度的6份樣品所測得的吸光度的平均值為0.332，RSD值為2.55%。

2.4.2 方法重現(xiàn)性實驗

將同一樣品溶液，在同一薄層板上進(jìn)行6次獨(dú)立的測定，測定結(jié)果如表3所示。從表3可知，重現(xiàn)性測定結(jié)果的平均值為0.331，最大偏差為3%，RSD值為2.37%。

精密度主要反映分析方法存在的隨機(jī)誤差的大小，從平行性和重現(xiàn)性兩個性質(zhì)進(jìn)行測量。其中平行性主要分析周圍環(huán)境對實驗方法引起的誤差，重現(xiàn)性主要分析試驗儀器體系所引起的誤差。由精密度實驗結(jié)果可知，RSD值在2.5%左右，屬于低精密度的檢測方法[22]，說明檢測方法的精密度不高，但經(jīng)多次實驗降低隨機(jī)誤差后可提高其精密度。

表3 重現(xiàn)性測定結(jié)果Table 3ble3 Results of replicate determinations

2.5 準(zhǔn)確度實驗

精密吸取甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品50mg，添加已知含量的混合油樣50mg，混合后定容至1000mL，按樣品測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收實驗測定結(jié)果Table4 Spike recovery of the developed method

準(zhǔn)確度為檢測方法存在系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差的綜合指標(biāo)，并決定分析結(jié)果的可靠性。從表4加樣回收測定結(jié)果可見，平均回收率為99.8%，RSD值為1.61%。由準(zhǔn)確度實驗結(jié)果可知，本實驗處理過程中樣品的損失較少，準(zhǔn)確度良好。

2.6 樣品的測定

在無溶劑體系中，以固定化脂肪酶催化甘油解反應(yīng)，甘油/油物質(zhì)的量比為2:1，甘油含水量為1%，反應(yīng)12h，分別在35、40、45℃制備不同含量的甘油酯混合物。取50mg樣品定容至1000mL進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。

由表5可知，精密度范圍在2.55%～2.88%之間，可見本方法可以測定混合甘油酯中甘油三酯的含量。另外，隨著酶促反應(yīng)溫度的升高，樣品中甘油三酯含量呈現(xiàn)遞減的趨勢，說明隨溫度的升高酶促甘油解產(chǎn)物中甘油三酯的轉(zhuǎn)化率提高。

表5 樣品測定結(jié)果(n =6)Table5 Results of determinations of triglyceride content in samples ( n=6)

2.7 檢測線的測定

將100μL磷鉬酸乙醇溶液點(diǎn)在薄層板上，105℃條件下烘烤5min，用濃氨水熏去除背景影響，做20組平行，測得吸光度平均值為0.017，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.001468，得到本檢測方法的檢測限為0.55μg/mL，定量檢測下限為1.83μg/mL。

2.8 方法引起誤差因素

本研究獲得的檢測方法可在常規(guī)條件下進(jìn)行，分析過程中所使用的儀器均為常規(guī)儀器，操作簡單方便，易于學(xué)習(xí)。引起本研究誤差因素主要有以下3點(diǎn)：由于本研究定量級為微克，應(yīng)注意操作的準(zhǔn)確度，否則會使數(shù)據(jù)造成相當(dāng)大的偏差；薄層板的均勻程度對實驗影響較大，如薄層過薄會使樣品點(diǎn)的面積增大，從而使實驗結(jié)果偏大；顯色時間應(yīng)嚴(yán)格的控制在相同的時間，時間過短，反應(yīng)不夠完全，使測量值偏低；時間過長，會使顯色劑過度反應(yīng)，使測量結(jié)果偏高，最佳的顯色反應(yīng)時間應(yīng)在5min左右。

3 結(jié) 論

本研究建立應(yīng)用薄層色譜-可見分光光度法定量測定甘油三酯含量的方法。本方法的平均回收率為99.8%，有良好的準(zhǔn)確度，精密度略低。研究獲得了高純度的甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品，在10～100μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；在保證5min左右固定顯色時間條件下，1.5h內(nèi)檢測結(jié)果的穩(wěn)定性良好；樣品的檢測限為0.55μg/mL，定量檢測下限為1.83μg/mL。檢測時間大約為2h，最多可分析12個樣品，其樣品組分應(yīng)不多于5種。

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Determination of Triglyceride Content in Oils and Fats by Thin Layer Chromatography

BAO Fang-yu1，ZHANG Min1,2,*
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100037, China)

A method for the determination of triglyceride content in oils and fats was established using thin layer chromatography (TLC) -visible spectrophotometry and internal standard quantification. High-purity triglyceride was separated by silica gel column chromatography from mixed glycerides for use as a reference substance. For the spectrophotometric determination of triglyceride content at 700 nm, triglyceride was separated by TLC before color development. The average recovery rate of the developed method was 99.8%, with high accuracy but slightly lower precision. An excellent linear relationship was observed for the calibration curve established using the prepared triglyceride standard over the concentration range of10 to 100 μg/mL. Good stability was achieved by color development for5 min and detection of the eluates within 1.5 h. The limit of detection for triglyceride was 0.55 μg/mL. This method can provide a simple and quick method for the determination of triglyceride conternt.

TLC-spectrophotometry；mixed glycerides；triglyceride standard

TS227

A

1002-6630(2013)04-0125-04

2012-07-06

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2009BADB9B08)；國家“863”計劃項目(2010AA101503)

鮑方宇(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：fangyu8023@126.com

*通信作者：張敏(1972—)，女，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：xzm7777@sina.com