周 延，王 芳，王 琳

（1 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院制藥工程系，北京100029；2 中國(guó)水利水電科學(xué)研究院水資源研究所，北京100044）

“柴達(dá)木”是蒙古語(yǔ) “鹽澤”之意，現(xiàn)有湖泊33個(gè)。各國(guó)學(xué)者對(duì)鹽環(huán)境微生物尤其是嗜鹽菌的各個(gè)方面進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)了許多新的微生物類群。近年來(lái)證實(shí)了鹽環(huán)境中獨(dú)特微生物群系的存在，且大多群系是依賴于鹽環(huán)境且只有不到0.01%～10%的微生物可以得到純培養(yǎng)［1－3］，其中大部分微生物在鹽環(huán)境破壞后將無(wú)法生存［4］。

與淡水湖相比，鹽湖生態(tài)系統(tǒng)組成相對(duì)簡(jiǎn)單和單一，以微生物為主要生物類群，特別是其特有的微生物系統(tǒng)對(duì)鹽湖湖水的物理化學(xué)環(huán)境有著非常強(qiáng)的依賴關(guān)系，湖水組成一旦變化，必然引起微生物系統(tǒng)的變化，其中不能適應(yīng)這種變化的微生物將面臨消失的危險(xiǎn)。另一方面，鹽湖受到來(lái)自人類活動(dòng)和自然環(huán)境因素變化的雙重威脅，這些威脅甚至大于對(duì)淡水湖泊的威脅，因?yàn)槿藗兺ǔＵJ(rèn)為鹽湖沒(méi)有內(nèi)陸的各種淡水水體那么重要和有價(jià)值，可以不采取保護(hù)措施，以至于不少鹽湖在過(guò)去的開發(fā)中，水位大幅下降和鹽度上升，甚至有些湖泊，如團(tuán)結(jié)湖，已經(jīng)成為排放鹽田老鹵的地方。鹽湖如何保護(hù)，保護(hù)什么？這一問(wèn)題現(xiàn)在仍沒(méi)有被重視。

對(duì)我國(guó)西北部鹽環(huán)境微生物進(jìn)行的大量研究工作充分證明了青海鹽環(huán)境中存在豐富的微生物多樣性、存在較多的新的微生物類群，并且潛藏著能產(chǎn)生較強(qiáng)生物活性的微生物資源［5－9］。在此基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用PCR－DGGE、普通PCR和培養(yǎng)法結(jié)合對(duì)柴達(dá)木盆地中的7個(gè)鹽湖、3個(gè)咸水湖、2個(gè)淡水湖及鹽田的湖水細(xì)菌多樣性進(jìn)行了調(diào)查，旨在總結(jié)其微生物類群的分布規(guī)律，并試圖就鹽度對(duì)細(xì)菌種群的影響進(jìn)行深入探討，以期對(duì)鹽湖生態(tài)資源的保護(hù)有所參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與總DNA提取

湖水樣品采自青海省柴達(dá)木盆地淡水湖：可魯克湖和小蘇干湖；咸水湖：尕海湖、托素湖、大蘇干湖；鹽湖：都蘭湖，柯柯鹽湖，大柴旦湖，南霍布遜湖，小柴旦湖，東臺(tái)吉乃爾湖，達(dá)布遜湖，察爾汗鹽田，南霍布遜鹽田。

500 m L湖水樣品經(jīng)0.22μ濾膜過(guò)濾，濾膜加入純水震蕩均勻，離心后用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA。

1.2 PCR－DGGE擴(kuò)增

PCR－DGGE 16S r DNA引物［10－11］：

樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后濃縮進(jìn)行DGGE電泳，用以比較不同樣品中菌群分布和差異。

1.3 普通PCR擴(kuò)增

普通PCR 16S r DNA擴(kuò)增引物［12－15］：

普通PCR擴(kuò)增得到的16S r DNA擴(kuò)增片段用瓊脂糖凝膠電泳純化后連接p MD19－T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為E.coli DH5α，每個(gè)樣品隨機(jī)選取40個(gè)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行測(cè)序，用以了解樣品中主要菌群類型。

1.4 培養(yǎng)法

培養(yǎng)基［16］：①CM培養(yǎng)基（／L）：Casamino acids 7.50 g，Yeast extract 10.00 g，Na3－citrate 3.00 g，KCl 2.00 g，MgSO4·7H2O 20.00 g，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.05 g，NaCl 200.00 g，p H＝7.2；②HM培養(yǎng)基（／L）：NaCl 100.0 g，KCl 2.0，MgSO4·7H2O 1.0 g，CaCl2·2H2O 0.36 g，Na HCO30.06 g，Yeast extract 10.0 g，Glucose 1.0 g，p H＝7.2～7.4；③APA培養(yǎng)基（／L）：NaCl 20.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7 H2O 1.0 g，Na2CO310.0 g，Yeast extract 5.0 g，Glucose 1.0 g，p H＝9～10。

采用3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基在用于相應(yīng)樣品時(shí)進(jìn)行適當(dāng)鹽度調(diào)整。水樣經(jīng)經(jīng)0.22μ濾膜過(guò)濾，將濾膜加入液體培養(yǎng)基震蕩均勻后，梯度稀釋涂布平板。37℃培養(yǎng)3～15 d，劃線至獲得單菌落。菌株用甘油管法保存［16］。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽田細(xì)菌多樣性情況

應(yīng)用PCR－DGGE法測(cè)試了淡水湖（可魯克湖，小蘇干湖）、咸淡水湖 （尕海，托素湖，大蘇干湖）、鹽湖 （都蘭湖，柯柯鹽湖，大柴旦湖，南霍布遜湖，小柴旦湖，東臺(tái)吉乃爾湖，達(dá)布遜湖）和察爾汗鹽田、南霍布遜鹽田的樣品。共得到不同位置的譜帶32個(gè)，根據(jù)DGGE原理，表明在所測(cè)樣本中至少存在32個(gè)不同種屬的微生物。各鹽湖的PCR－DGGE電泳譜圖見圖1。培養(yǎng)法和普通PCR轉(zhuǎn)化后測(cè)得的菌屬代表了柴達(dá)木各湖泊的主要細(xì)菌種屬，鑒定出的各樣點(diǎn)細(xì)菌可大致歸屬于12個(gè)屬的105個(gè)物種 （已另具文 “柴達(dá)木盆地鹽環(huán)境湖泊中鹽度對(duì)細(xì)菌多樣性影響的研究”，文章在投），其中包括了稀有的放線菌類群，如Kocuria等，這些菌屬在以往的研究中曾被報(bào)道［5－9］。其中Brevibacillus，Paenibacillus，Bacillus，Streptomyces屬中檢到的菌種數(shù)占所有檢出菌種數(shù)的84%，是鹽湖中存在的主要菌屬。對(duì)湖水的培養(yǎng)法和普通PCR法的研究結(jié)果顯示，柴達(dá)木盆地鹽湖內(nèi)存在豐富的微生物群系。

從東臺(tái)吉乃爾湖和南霍布遜湖的周邊鹽田和鹽廠樣品的細(xì)菌菌群分布 （表1）可以看到，在所檢鹽田只得到5個(gè)屬的細(xì)菌，鹽田細(xì)菌群屬種比鹽湖少50%以上。DGGE譜圖上，鹽田樣品的譜帶數(shù)（表2）也顯示鹽田微生物種群的減少。從主要菌屬的缺失來(lái)看，鹽田菌群與鹽湖已經(jīng)發(fā)生明顯變化，鹽田微生物種群的分布狹窄。

2.2 鹽湖細(xì)菌多樣性與水體特性的關(guān)系

為了進(jìn)一步了解湖水中細(xì)菌多樣性與湖水特征的關(guān)系，在托素湖與大蘇干湖分別選取了4個(gè)取樣點(diǎn)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。托素湖與大蘇干湖的共同點(diǎn)是二者均通過(guò)地表徑流與淡水湖相連，因而從淡水入口到遠(yuǎn)端形成了不同的湖水鹽度 （圖2），如果4個(gè)樣品中微生物存在差異，則這個(gè)差異只可能是由于湖水差異造成的。

圖1 PCR－DGGE電泳譜帶示意圖

表1 鹽湖周邊鹽田的菌群變化

表2 鹽田DGGE譜帶結(jié)果

圖2 大蘇干湖和托素湖取樣點(diǎn)示意圖

表3 局部環(huán)境對(duì)湖泊微生物群落的影響

從樣品的DGGE結(jié)果（表3）來(lái)看，湖中取自遠(yuǎn)離淡水入口處的樣品 （大蘇干湖1＃樣與2＃樣，托素湖3＃樣與4＃樣）的DGGE譜帶顯示更明顯的咸水湖特征。兩湖的1＃與2＃、3＃與4＃取樣點(diǎn)的鹽度相近，其DGGE譜圖也幾乎相同。鹽度不同的樣品（如1＃，3＃樣）DGGE譜帶則有一定差異。托素湖和大蘇干湖4個(gè)湖水樣品的DGGE譜帶差異的主要原因應(yīng)該是湖水差異導(dǎo)致的，更確切地說(shuō)，在這里是湖水鹽度的變化帶來(lái)的。

由于鹽度對(duì)菌群分布的決定作用造成了在湖中依鹽度變化，形成了微生物的過(guò)渡形分布，帶來(lái)了托素湖和大蘇干湖不同位置取得樣品的DGGE譜圖的差異性。這說(shuō)明湖水特性，尤其是湖水的鹽度，對(duì)細(xì)菌種屬的分布有較大影響。

2.3 鹽湖微生物鹽度的臨界條件探討

在本次研究所調(diào)查的鹽湖中，大柴旦湖、小柴旦湖、柯柯鹽湖、東臺(tái)吉乃爾湖、達(dá)布遜湖均為硫酸鎂亞型鹽湖，其水中主體礦物組成特性相近。在這幾個(gè)鹽湖中，湖水的物理化學(xué)因子的影響，尤其是礦化度 （鹽分濃度）和p H值，是湖水中微生物的種類和數(shù)量不同的主因。而礦化度和p H值呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，即礦化度高的湖泊一般為酸性或微酸性湖泊，礦化度較低的湖泊為堿性或微堿性湖泊。

表4 硫酸鎂亞型鹽湖比較

同為硫酸鎂亞型的大柴旦鹽湖、柯柯鹽湖、東臺(tái)吉乃爾湖、小柴旦湖和達(dá)布遜湖，其礦化度、p H值和菌種個(gè)數(shù)和主菌數(shù)見表4和圖3。尕海的礦化度較低，菌種數(shù)為26，主菌屬數(shù)為4——即Brevibacillus，Paenibacillus，Bacillus，Streptomyces屬的菌株。這些硫酸鎂亞型湖泊與低礦化度的尕海相比，隨著水體的礦化度升高，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種數(shù)變化不大。但是，當(dāng)?shù)V化度從大柴旦湖的274.438 g／L升高到小柴旦湖的339.074 g／L，鑒定得到的菌種數(shù)從13變?yōu)?；當(dāng)?shù)V化度到達(dá)布遜湖的470.18 g／L后，菌種數(shù)為5，低于尕海菌種數(shù)的20%，且主菌屬數(shù)變?yōu)?，有兩個(gè)屬的菌消失了。因此，礦化度在350～450 g／L可能為鹽濃度影響較大的過(guò)渡區(qū)，一旦礦化度高于450 g／L，鹽湖微生物一些主要菌屬開始消失，鹽湖生態(tài)將發(fā)生質(zhì)的變化。

圖3 鹽湖鑒定結(jié)果比較

對(duì)于礦化度在270～350 g／L內(nèi)的鹽湖，330 g／L的東臺(tái)吉乃爾湖與339 g／L的小柴旦湖DGGE譜帶數(shù)驟減引起我們的關(guān)注。表明在這里存在引起微生物某些變化的突出因素。據(jù)文獻(xiàn)［17］報(bào)道，硫酸鎂亞行鹵水在330～360 g／L嚴(yán)重結(jié)鹽，且Na＋／Mg2＋比高于0.5時(shí)結(jié)鹽嚴(yán)重，研究涉及的幾個(gè)湖此系數(shù)均高于0.5。因此認(rèn)為鹽湖鹵水結(jié)鹽可能是引起湖水中微生物種群減少的重要因素。考慮到鹽湖供水流量的變化，可以考慮以330 g／L作為硫酸鎂亞行鹽湖生態(tài)穩(wěn)定的閥值。

綜上所述，鹽湖和咸淡水湖中的研究表明，在鹽湖生態(tài)系統(tǒng)中，鹽度和p H值是決定生物物種多樣性及其個(gè)體豐度的關(guān)鍵因素。認(rèn)為330 g／L可以考慮作為硫酸鎂亞型鹽湖生態(tài)變化控制的參考臨界值。

3 結(jié) 論

本文應(yīng)用PCR－DGGE法測(cè)試了柴達(dá)木盆地的12個(gè)湖泊和察爾汗鹽田、南霍布遜鹽田的樣品，結(jié)果顯示鹽田細(xì)菌屬種比鹽湖少50%以上。鹽田菌群與鹽湖已經(jīng)發(fā)生明顯變化，鹽田開采如果不加以控制，勢(shì)必造成鹽湖生態(tài)的不可逆變化。

托素湖和大蘇干湖不同位置取得樣品的DGGE譜圖的差異性證明了湖水特性，尤其是湖水的鹽分濃度，對(duì)細(xì)菌種屬的分布有較大影響。該結(jié)果提示，鹽度可以作為對(duì)鹽湖菌群保護(hù)的重要指標(biāo)之一。對(duì)同為硫酸鎂亞型的鹽湖和咸淡水湖中的研究表明，在鹽湖生態(tài)系統(tǒng)中，鹽度和p H值是決定生物物種多樣性的關(guān)鍵因素。并提出將330 g／L作為硫酸鎂亞型鹽湖生態(tài)變化控制的參考臨界值。

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