陶 然 劉 浥 殷宗琦 汪振星 李 丹 周廣東

·論著·

利用軟骨細(xì)胞膜片技術(shù)在山羊皮下構(gòu)建軟骨樣組織的研究

陶 然 劉 浥 殷宗琦 汪振星 李 丹 周廣東

目的探討軟骨細(xì)胞膜片技術(shù)在大型哺乳動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建軟骨的優(yōu)越性。方法以山羊耳廓軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞，分別利用細(xì)胞膜片技術(shù)（實(shí)驗(yàn)組）和細(xì)胞復(fù)合PGA/PLA支架材料的方法（對(duì)照組）構(gòu)建軟骨組織。體外培養(yǎng)4周回植到動(dòng)物腹部皮下，分別于回植前、回植后4周及回植后8周時(shí)采集標(biāo)本，觀察比較兩組軟骨形成情況。結(jié)果體外培養(yǎng)4周后，兩組均形成一定量的軟骨樣組織，但對(duì)照組可見未降解的材料纖維；體內(nèi)構(gòu)建4周后，實(shí)驗(yàn)組形成成熟軟骨樣組織，對(duì)照組為纖維結(jié)締組織替代，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤；體內(nèi)培養(yǎng)8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組較4周前無明顯變化，對(duì)照組體積明顯縮小，仍為纖維結(jié)締組織。結(jié)論軟骨細(xì)胞膜片技術(shù)與細(xì)胞復(fù)合PGA/PLA支架材料構(gòu)建組織工程軟骨方法相比，原代細(xì)胞用量少，體外培養(yǎng)時(shí)間短，在大動(dòng)物體內(nèi)能形成成熟軟骨，具有更廣泛的臨床應(yīng)用前景。

組織工程化軟骨細(xì)胞膜片聚乙酸聚乳酸炎癥反應(yīng)

目前，聚乙酸（Polyglycolic acid，PGA）/聚乳酸（Polylactic acid，PLA）混合材料是體內(nèi)外構(gòu)建組織工程化軟骨最常用的支架材料之一。我們的前期研究證明，用PGA/PLA支架材料，不論是混合軟骨細(xì)胞還是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），均能在體外構(gòu)建出具有一定生物力學(xué)強(qiáng)度的軟骨樣組織，也能于裸鼠體內(nèi)構(gòu)建出成熟的軟骨樣組織[1-2]。但以PGA/PLA支架材料構(gòu)建軟骨也存在一些缺點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)，由于軟骨細(xì)胞在體外擴(kuò)增過程中容易出現(xiàn)老化，而以PGA/PLA支架材料構(gòu)建軟骨，要求種子細(xì)胞快速大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)，所以接種至PGA/PLA支架材料的軟骨細(xì)胞通常選擇第1代，因此對(duì)原代細(xì)胞的需求量大。另外，PGA/PLA支架材料在具有完全免疫功能的大動(dòng)物體內(nèi)，會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，影響軟骨組織的構(gòu)建[1，3]。

為了在大型哺乳動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨，我們嘗試選擇無支架材料的構(gòu)建方式[4-6]。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，通過高密度接種軟骨細(xì)胞，可以在體外構(gòu)建出較大體積的軟骨樣復(fù)層細(xì)胞膜片。由于軟骨細(xì)胞在堿性成纖維生長因子存在時(shí)[7]，在三維空間中互相接觸，會(huì)維持分化現(xiàn)象[8]。這種技術(shù)對(duì)軟骨細(xì)胞的代次要求較低，第4代的軟骨細(xì)胞也可構(gòu)建出軟骨樣組織，大大降低了對(duì)原代細(xì)胞的需求量。

為了進(jìn)一步證實(shí)該技術(shù)在構(gòu)建組織工程軟骨，尤其是在大型哺乳動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建軟骨中的重要性，本研究將軟骨細(xì)胞膜片技術(shù)和PGA/PLA材料細(xì)胞混合構(gòu)建技術(shù)的部分參數(shù)及構(gòu)建結(jié)果進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本組5只山羊均來源于上海甲干生物科技有限公司，雌雄不限，平均體質(zhì)量（20.0±3.0）Kg。實(shí)驗(yàn)過程中均依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)指南的要求進(jìn)行。每只動(dòng)物左側(cè)腹部皮下回植軟骨細(xì)胞膜片（實(shí)驗(yàn)組，n=5），右側(cè)腹部皮下回植PGA/PLA細(xì)胞材料復(fù)合物（對(duì)照組，n=5）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Worthington公司，美國）；高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；胎牛血清（Hyclone公司，美國）；細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)盒（CCK-8，東仁化學(xué)科技有限公司，上海）；無紡PGA纖維（組織工程國家工程中心）。

1.3 原代細(xì)胞的獲取及擴(kuò)增

每只動(dòng)物取約2.0 cm×2.0 cm大小的耳廓軟骨，將軟骨塊剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，震蕩消化30 min，然后沖洗3遍，加入0.25%Ⅱ型膠原酶，震蕩消化7~8 h[7]。獲得的消化液用100 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，離心，去上清液，沉淀的細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，所得細(xì)胞以1×104cells/cm2的濃度接種在100 mm培養(yǎng)皿上，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清、2 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液）培養(yǎng)擴(kuò)增，待軟骨細(xì)胞生長至70%~80%融合時(shí)進(jìn)行傳代[9]。

1.4 繪制細(xì)胞生長曲線

將不同代次的細(xì)胞以2 000個(gè)/孔接種于96孔板，用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。每個(gè)96孔板接種一個(gè)代次的細(xì)胞，每板接種5行，每行接種5個(gè)孔。分別于第1、3、5、7、9天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每次計(jì)數(shù)每板中的一行，先將培養(yǎng)基吸盡，加入100 μL DMEM及10 μL CCK-8試劑，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5 材料/細(xì)胞混合物的制備

15 mg無紡PGA纖維制成1.0 cm×1.0 cm×0.1 cm大小，將1%PLA二氯甲烷溶液均勻滴在PGA纖維上，使PGA/PLA混合材料總質(zhì)量達(dá)到16.5 mg[10]。75%乙醇消毒，PBS沖洗3次。將第1代軟骨細(xì)胞用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液制備成6×107cells/mL濃度的細(xì)胞混懸液，均勻滴在PGA/PLA支架材料上。在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h[9]，加入軟骨組織培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，10 ng/mL轉(zhuǎn)化生長因子-β1，1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基）繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。體外培養(yǎng)4周后，將PGA/PLA細(xì)胞材料復(fù)合物植入山羊腹部皮下。

1.6 細(xì)胞膜片的制備

留取一100 mm培養(yǎng)皿的第1代細(xì)胞（基礎(chǔ)皿），每3天用軟骨組織培養(yǎng)液換液一次，直至制備細(xì)胞膜片。將第4代軟骨細(xì)胞消化，離心，重懸，以8×105cells/cm2濃度接種于之前留取的第1代細(xì)胞上，以軟骨組織培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天換液。體外培養(yǎng)4周時(shí)，可在培養(yǎng)皿中揭起一直徑100 mm的軟骨細(xì)胞膜片，將膜片切割成1.0 cm×1.0 cm大小，每兩塊疊加在一起回植于皮下組織內(nèi)，剩余部分用于組織學(xué)檢測(cè)。

1.7 組織學(xué)檢測(cè)

每組分別于回植前（體外培養(yǎng)4周）、體內(nèi)培養(yǎng)4周和體內(nèi)培養(yǎng)8周時(shí)，各取5個(gè)樣本，觀察大體外觀。然后，將標(biāo)本以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋及切片（5 μm厚），行HE染色及油紅-O染色，觀察組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Ⅱ型膠原的表達(dá)情況，證明構(gòu)建組織的軟骨表型[11]。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05時(shí)差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同代次軟骨細(xì)胞生長曲線

添加了堿性成纖維生長因子的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)軟骨細(xì)胞后，軟骨細(xì)胞在形態(tài)上沒有出現(xiàn)明顯老化的表現(xiàn)。光鏡下原代至第4代間的軟骨細(xì)胞，形態(tài)無明顯差異（圖1A-E）。生長曲線表明，不同代次的軟骨細(xì)胞在此培養(yǎng)體系下擴(kuò)增能力無明顯差異（圖1F）。說明所用的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液具有維持軟骨細(xì)胞表型的功能。

2.2 體外培養(yǎng)4周、體內(nèi)培養(yǎng)4周及8周后構(gòu)建組織大體及組織學(xué)觀察

體外培養(yǎng)4周后，PGA/PLA細(xì)胞材料復(fù)合物維持原有大小形態(tài)；組織學(xué)檢測(cè)表明，已分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，形成部分軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，但仍有大量PGA/PLA材料未降解（圖2D-F）。高密度接種于培養(yǎng)皿上的軟骨細(xì)胞，在體外培養(yǎng)4周后已形成一片完整的膜片樣組織（圖2A），組織學(xué)證實(shí)為軟骨樣組織，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，形成特異性軟骨陷窩（圖2B-C）。

體內(nèi)構(gòu)建4周后，大體觀察見實(shí)驗(yàn)組形成成熟軟骨樣組織，大小沒有明顯改變；而對(duì)照組未形成軟骨樣組織（圖3A、E）；組織學(xué)檢測(cè)證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組形成成熟的軟骨組織（圖3B-D），而對(duì)照組未形成軟骨樣組織，為纖維結(jié)締組織，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤（圖3F-H）。體內(nèi)構(gòu)建8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組較體內(nèi)4周時(shí)無明顯變化（圖4A-D），對(duì)照組體積明顯縮小，組織學(xué)檢測(cè)仍為纖維結(jié)締組織（圖4E-H）。

圖1 不同代次軟骨細(xì)胞形態(tài)及生長曲線（100×）Fig.1 Morphological observation and growth curve of chondrocytes in different passage(100×)

圖2 體外培養(yǎng)4周構(gòu)建組織大體觀及組織學(xué)（100×）Fig.2 Gross view and histological observation of constructs in each group after cultured for 4 weeks in vitro(100×)

圖3 體內(nèi)4周組織大體觀及組織學(xué)（100×）Fig.3 Gross view and histological observation of tissue harvested in each group after implantation for 4 weeks(100×)

圖4 體內(nèi)8周組織大體觀及組織學(xué)（100×）Fig.4 Gross view and histological observation of tissue harvested in each group after implantation for 8 weeks(100×)

3 討論

目前，用軟骨細(xì)胞混合PGA/PLA支架材料體外構(gòu)建軟骨的組織工程技術(shù)已經(jīng)比較成熟。但是，該方法對(duì)軟骨細(xì)胞代次要求高。大量研究已經(jīng)證實(shí)[12-13]，軟骨細(xì)胞在體外擴(kuò)增過程中易老化，喪失軟骨細(xì)胞特征性表型，分泌軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)的能力明顯下降。而PGA/PLA支架材料構(gòu)建軟骨，要求隨著支架材料的降解，種子細(xì)胞能快速大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)，所以用于接種PGA/PLA支架材料的軟骨細(xì)胞需要具備軟骨細(xì)胞表型及較強(qiáng)的分泌軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)的能力，通常選擇第1代細(xì)胞，因此這種構(gòu)建方法需要大量的原代細(xì)胞，對(duì)供體造成的損傷比較大。另外，PGA/PLA支架材料雖然生物相容性好，和細(xì)胞親和性高，但是植入具有完全免疫功能的動(dòng)物體內(nèi)后，其酸性降解產(chǎn)物會(huì)引起強(qiáng)烈的無菌性炎癥，嚴(yán)重影響軟骨組織形成。因此，我們排除支架材料可能引起炎癥反應(yīng)的影響，單純利用細(xì)胞在大動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建軟骨組織。

軟骨細(xì)胞在傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)體系下擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)，隨著代次增高，會(huì)逐漸呈現(xiàn)老化的現(xiàn)象，喪失軟骨細(xì)胞特征性表型，Ⅱ型膠原分泌量減少，而代表成纖維細(xì)胞特征的Ⅰ型膠原分泌會(huì)增多[14-15]。但是，有研究指出，老化的軟骨細(xì)胞在“細(xì)胞堆積”的培養(yǎng)狀態(tài)下會(huì)出現(xiàn)再分化，重新表達(dá)軟骨細(xì)胞特征性表型，并分泌特征性的軟骨外基質(zhì)[16-17]。軟骨細(xì)胞分泌的基質(zhì)中含有轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、胰島素樣生長因子1（IGF-1），能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成為軟骨細(xì)胞，并維持軟骨細(xì)胞表型[18-19]。使用細(xì)胞膜片法時(shí)，基礎(chǔ)皿中的原代細(xì)胞軟骨表型特征明顯，能大量分泌軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，在10 d左右就能形成薄層軟骨細(xì)胞膜。這為擴(kuò)增所得的低代次細(xì)胞堆積再分化并維持其特征性表型提供了良好的條件，并能將擴(kuò)增所得的細(xì)胞連成整體[5]。而這一方法也符合“細(xì)胞堆積”的理念。本實(shí)驗(yàn)在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了堿性成纖維生長因子，這是一種促細(xì)胞分裂增殖活性的生長因子，能進(jìn)一步提高軟骨細(xì)胞的擴(kuò)增能力，降低軟骨細(xì)胞在擴(kuò)增過程中出現(xiàn)老化的可能。研究結(jié)果證實(shí)，即使利用擴(kuò)增至第4代的軟骨細(xì)胞，仍然能在體外構(gòu)建出軟骨樣組織，體積未縮小，具有一定的生物力學(xué)強(qiáng)度。

本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過體外培養(yǎng)4周，兩組都可在體外構(gòu)建出軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，但是實(shí)驗(yàn)組形成的軟骨樣組織更致密，更成熟；對(duì)照組陷窩結(jié)構(gòu)較少，仍有PGA/PLA材料纖維殘留。在之前的研究中，我們通過延長體外培養(yǎng)時(shí)間至2周的方法，可以降低PGA/ PLA支架在兔體內(nèi)引起的炎癥反應(yīng)[2]。我們認(rèn)為，通過體外培養(yǎng)，分泌的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)可以部分包裹PAG/PLA纖維，減少機(jī)體與材料的接觸，從而降低炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)將體外培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步延長至4周，希望材料進(jìn)一步降解并被包裹。但大型哺乳動(dòng)物的免疫功能較兔更加完整，即使體外培養(yǎng)延長至4周，殘留的少量PAG/PLA支架材料在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮下產(chǎn)生的酸性降解產(chǎn)物就能激活具有完整免疫功能的大動(dòng)物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，引起大量炎癥細(xì)胞浸潤，嚴(yán)重影響軟骨的形成[20]。因此，對(duì)照組在體內(nèi)4周和8周時(shí)，都不能形成軟骨樣組織。實(shí)驗(yàn)組去除了材料引起炎癥反應(yīng)的可能，單純植入細(xì)胞構(gòu)建成的軟骨樣組織，除手術(shù)創(chuàng)傷引起的炎癥反應(yīng)外，不會(huì)引起其他的影響軟骨形成的免疫反應(yīng)，所以在體內(nèi)構(gòu)建4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組就可以形成成熟的軟骨樣組織，延長體內(nèi)構(gòu)建時(shí)間，對(duì)組織形成沒有明顯影響。

4 結(jié)論

利用軟骨細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建軟骨，與PGA/PLA細(xì)胞材料復(fù)合的構(gòu)建方法相比，具有原代細(xì)胞用量少、供區(qū)損傷小、可早期回植、在大動(dòng)物體內(nèi)基本不引起炎癥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。今后擬利用該項(xiàng)技術(shù)構(gòu)建特殊形狀的軟骨組織，以滿足不同部位軟骨缺損修復(fù)的需要，為實(shí)現(xiàn)軟骨組織工程技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

[1]羅旭松.構(gòu)建組織工程管狀軟骨修復(fù)氣管節(jié)段性缺損[D].上海：上海交通大學(xué),2008.

[2]羅旭松,周廣東,劉偉,等.體內(nèi)外聯(lián)合培養(yǎng)提高組織工程管狀軟骨構(gòu)建質(zhì)量[J].中國美容整形外科雜志,2010,21(4)：208-211.

[3]Asawa Y,Sakamoto T,Komura M,et al.Early-stage foreign body reaction against biodegradable polymer scaffolds affects tissue regeneration during the autologous transplantation of tissue engineered cartilage in the canine model[J].Cell Transplant, 2012,21(7)：1431-1442.

[4]Ebihara G,Sato M,Yamato M,et al.Cartilage repair in transplanted scaffold-free chondrocyte sheets using a minipig model[J].Biomaterials,2012,33(15)：3846-3851.

[5]Wu W,Cheng X,Zhao Y,et al.Tissue engineering of trachealikecartilagegraftsbyusingchondrocytemacroaggregate：experimental study in rabbits[J].Artif Organs,2007,31(11)：826-834.

[6]Park K,Huang J,Azar F,et al.Scaffold-free,engineered porcine cartilage construct for cartilage defect repair-in vitro and in vivo study[J].Artif Organs,2006,30(8)：586-596.

[7]Li Q,Liu T,Zhang L,et al.The role of bFGF in down-regulating alpha-SMA expression of chondrogenically induced BMSCs and preventing the shrinkage of BMSC engineered cartilage[J]. Biomaterials,2011,32(21)：4773-4781.

[8]Caron MM,Emans PJ,Coolsen MM,et al.Redifferentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes：comparison of 2D and 3D cultures[J].Osteoarthritis Cartilage,2012,20(10)：1170-1178.

[9]Luo X,Zhou G,Liu W,et al.In vitro precultivation alleviates post-implantation inflammation and enhances development of tissue-engineered tubular cartilage[J].Biomed Mater,2009,4(2)：025006.

[10]Liu Y,Zhang L,Zhou G,et al.In vitro engineering of human ear-shaped cartilage assisted with CAD/CAM technology[J]. Biomaterials,2010,31(8)：2176-2183.

[11]Xue JX,Gong YY,Zhou GD,et al.Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells induced by acellular cartilage sheets[J].Biomaterials,2012,33(24)：5832-5840.

[12]Brodkin KR,Garcia AJ,Levenston ME.Chondrocyte phenotypes on different extracellular matrix monolayers[J].Biomaterials, 2004,25(28)：5929-5938.

[13]Thirion S,Berenbaum F.Culture and phenotyping of chondrocytes in primary culture[J].Methods Mol Med,2004,100：1-14.

[14]Mallein-Gerin F,Garrone R,van der Rest M.Proteoglycan and collagen synthesis are correlated with actin organization in dedifferentiating chondrocytes[J].Eur J Cell Biol,1991,56(2)：364-373.

[15]Darling EM,Athanasiou KA.Rapid phenotypic changes in passaged articular chondrocyte subpopulations[J].J Orthop Res,2005,23 (2)：425-432.

[16]Schulze-Tanzil G,de Souza P,Villegas Castrejon H,et al. Redifferentiation of dedifferentiated human chondrocytes in highdensity cultures[J].Cell Tissue Res,2002,308(3)：371-379.

[17]Schuh E,Hofmann S,Stok K,et al.Chondrocyte redifferentiation in 3D：the effect of adhesion site density and substrate elasticity [J].J Biomed Mater Res A,2012,100(1)：38-47.

[18]Pedrozo HA,Schwartz Z,Gomez R,et al.Growth plate chondrocytes store latent transforming growth factor(TGF)-beta 1 in their matrix through latent TGF-beta 1 binding protein-1[J].J Cell Physiol,1998,177(2)：343-354.

[19]周廣東,苗春雷,王曉云,等.軟骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體外軟骨形成的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,84(20)：1716-1720.

[20]Franz S,Rammelt S,Scharnweber D,et al.Immune responses to implants-a review of the implications for the design of immunomodulatory biomaterials[J].Biomaterials,2011,32(28)：6692-6709.

The Construction of Tissue Engineered Cartilage by Using Chondrocyte Cell-Sheet in Goat Model

TAO Ran,LIU Yi,YIN Zongqi,WANG Zhenxing,LI Dan,ZHOU Guangdong.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241,China. Corresponding author:ZHOU Guangdong(E-mail:guangdongzhou@126.com).

ObjectiveTo investigate the advantage of cell-sheet technology in constructing tissue engineered cartilage (TE)in goat model.MethodsTE cartilage was constructed by auricular chondrocytes of goats as seed cells with cell-sheet technology(experimental group)and PGA/PLA cell-material compound method(control group).Then the TE cartilage was implanted subcutaneously in the abdominal wall of goats after cultured for 4 weeks in vitro.Tissue specimens were collected to evaluate the chondrogenesis in two groups at three time points：before implantation,4 weeks after implantation and 8 weeks implantation.ResultsAfter 4 weeks cultured in vitro,cartilage phenotype was displayed in two groups by histology analysis,but large amount of PGA fibers was also observed in control group.Mature cartilage tissues were formed in experimental group after implanted for 4 weeks and 8 weeks.On the contrary,all the constructions tuned into fibrous tissue in control group 4 weeks after implantation,and significant shrink of volume was observed in control group 8 weeks after implantation.ConclusionCell-sheet technology,compared with PGA/PLA cell-material compound method,has more advantages including limited defect in donor site,short culture period in vitro and less inflammatory response in vivo.It would provide a promising approach for the regeneration of cartilage in vivo.

Tissue engineered cartilage;Cell-sheet;Polyglycolic acid;Polylactic acid;Inflammatory response

Q813.1+2

A

1673－0364（2013）02－0061－05

2013年2月26日；

2013年3月20日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.001

國家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃重大專項(xiàng)（863項(xiàng)目）（2012AA020507）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30973131，50830105，81000677）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科；200011上海市上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；200241上海市組織工程國家工程中心。

周廣東（E-mail：guangdongzhou@126.com）。