王志興 歐陽(yáng)火牛 程志華 郭智霖

局部缺血對(duì)面神經(jīng)損傷后雪旺細(xì)胞增殖的影響

王志興 歐陽(yáng)火牛 程志華 郭智霖

目的探討局部缺血對(duì)面神經(jīng)損傷后雪旺細(xì)胞增殖的影響，為臨床治療顱底骨折伴發(fā)面神經(jīng)損傷提供新的思路。方法75只SD雄性大鼠，分為對(duì)照組（30只）、實(shí)驗(yàn)組（30只）及空白組（15只）。對(duì)照組給予左側(cè)面神經(jīng)單純壓榨性損傷；實(shí)驗(yàn)組給予左側(cè)面神經(jīng)相同的壓榨性損傷后，顯微鏡下剝除神經(jīng)外膜周圍血管；空白組為假手術(shù)組。其中25只于術(shù)后3 d、7 d和21 d進(jìn)行行為學(xué)觀察及電生理檢測(cè)，另外50只于術(shù)后3 d、5 d和7 d采集面神經(jīng)標(biāo)本，S-100抗體標(biāo)記雪旺細(xì)胞，行免疫組化染色分析。結(jié)果電生理檢測(cè)及行為學(xué)分析顯示：空白組無(wú)面癱表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均出現(xiàn)面癱表現(xiàn)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，兩組面癱癥狀均有恢復(fù)，但實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)速度明顯緩慢；免疫組化顯示：術(shù)后3 d、5 d和7 d空白組雪旺細(xì)胞改變無(wú)明顯差異。術(shù)后3 d實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組雪旺細(xì)胞均開(kāi)始增殖，術(shù)后5 d兩組達(dá)到增殖高峰，術(shù)后7 d實(shí)驗(yàn)組雪旺細(xì)胞開(kāi)始明顯減少，對(duì)照組無(wú)明顯改變。結(jié)論與單純面神經(jīng)損傷比較，損傷伴缺血可明顯導(dǎo)致?lián)p傷處雪旺細(xì)胞的增殖減少，阻礙面神經(jīng)的修復(fù)。

大鼠面神經(jīng)損傷缺血增殖

面神經(jīng)屬于周圍神經(jīng)，損傷后，其遠(yuǎn)端發(fā)生華勒氏變性，而近端的軸突形成新的軸芽。損傷遠(yuǎn)端變性的軸突及髓鞘由雪旺細(xì)胞吞噬，同時(shí)形成Bungner′s帶，并為軸芽的生長(zhǎng)提供合適的環(huán)境，這一過(guò)程在神經(jīng)損傷修復(fù)中具有重要作用[1-3]。近年來(lái)，對(duì)雪旺細(xì)胞的增殖和功能的研究開(kāi)展較多[4]，但損傷伴缺血對(duì)修復(fù)影響的研究較少，而損傷伴缺血是顱底骨折伴發(fā)面神經(jīng)損傷的重要原因[5]。我們通過(guò)大鼠行為學(xué)觀察、電生理檢測(cè)及免疫組化染色等方法，研究損傷伴缺血對(duì)面神經(jīng)損傷處雪旺細(xì)胞增殖的影響，為臨床治療面神經(jīng)損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

75只SD雄性大鼠（上海第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量203～258 g，平均240 g。將其隨機(jī)分為損傷伴缺血組（實(shí)驗(yàn)組，30只），單純損傷組（對(duì)照組，30只）和空白組（15只），進(jìn)行雙側(cè)面部的自身對(duì)照。

1.2 損傷模型的建立

大鼠腹腔注射麻醉，術(shù)區(qū)消毒、備皮，取右側(cè)臥位，常規(guī)乙醇消毒鋪無(wú)菌洞巾后，沿耳下1 cm處橫向切開(kāi)皮膚及皮下筋膜，切口長(zhǎng)2 cm，在外耳道軟骨前緣后，沿外耳道軟骨前緣附近解剖出面神經(jīng)主干，并向尾側(cè)鈍性分離至外耳道軟骨后緣，完全暴露面神經(jīng)。手術(shù)組于面神經(jīng)出莖乳孔1 mm處用血管阻斷夾持續(xù)夾持3 min，然后手術(shù)顯微鏡下剝除神經(jīng)表面血管，對(duì)照組僅在面神經(jīng)出莖乳孔1 mm處用血管阻斷夾持續(xù)夾持3 min，空白組暴露面神經(jīng)后不作任何處理；徹底止血，逐層關(guān)閉術(shù)區(qū)。術(shù)后給予青霉素局部外用2 d，預(yù)防感染。

1.3 大體行為學(xué)觀察

大鼠在正常情況下，鼻端朝前，位于正中，觸須在活動(dòng)時(shí)對(duì)稱擺動(dòng)，角膜反射靈敏，可完全閉眼。

術(shù)后分別于3 d、7 d和21 d觀察大鼠的瞬目反射、觸須運(yùn)動(dòng)和鼻尖位置，并進(jìn)行評(píng)估[6]。

角膜反射（Corneal Reflex，CR）：用2 mL注射器裝18G針頭，距大鼠眼睛2 cm處，瞬間向眼內(nèi)吹入空氣，觀察大鼠眼瞼活動(dòng)及閉合情況。①雙側(cè)無(wú)明顯差異為0分；②患側(cè)較對(duì)側(cè)閉合延遲為1分；③患側(cè)眼瞼不能閉合為2分。

30 sec內(nèi)動(dòng)物雙側(cè)的觸須活動(dòng)（Tentacles Activities，TA）。①雙側(cè)觸須活動(dòng)無(wú)明顯差異為0分；②患側(cè)觸須活動(dòng)較對(duì)側(cè)減弱為1分；③患側(cè)觸須活動(dòng)消失為2分。

觀察大鼠鼻尖位置（Nose Position，NP）。①鼻尖居中為0分；②鼻尖偏向?qū)?cè)為1分。

評(píng)分：總分≥3時(shí)，動(dòng)物存在面神經(jīng)麻痹。

1.4 電生理檢測(cè)

術(shù)后分別于3 d、7 d和21 d對(duì)大鼠面神經(jīng)進(jìn)行電生理檢測(cè)，檢測(cè)采用Medelec Synergy T2生理記錄儀（Oxford Instruments公司）。檢測(cè)時(shí)，大鼠全麻并固定，暴露面神經(jīng)總干損傷部位周圍約10 mm，將刺激電極與神經(jīng)干近心端充分接觸，記錄電極插入口輪匝肌約3～5 mm，兩極距離為10 mm。刺激方式為方波刺激，波寬1 ms，從0 mV開(kāi)始增大刺激強(qiáng)度，直至出現(xiàn)最大反應(yīng)波幅為止。測(cè)定口輪匝肌復(fù)合動(dòng)作電位的最大波幅（Maximum Amplitude，MA）和潛伏期。

1.5 免疫組織化學(xué)

術(shù)后3 d、5 d和7 d取材，將取出的面神經(jīng)置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，免疫組織化學(xué)染色，S-100標(biāo)記雪旺細(xì)胞，Imagepro軟件進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有計(jì)數(shù)資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 面神經(jīng)功能評(píng)估

實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3 d左側(cè)角膜反射消失，觸須無(wú)活動(dòng)，鼻尖向右側(cè)歪斜；術(shù)后7 d有4只大鼠出現(xiàn)輕微角膜反射，5只觸須活動(dòng)部分恢復(fù)，但閉眼不全，所有大鼠鼻尖歪斜無(wú)恢復(fù)；術(shù)后21 d有1只大鼠角膜反射完全恢復(fù)，5只大鼠出現(xiàn)輕微角膜反射，2只觸須活動(dòng)完全恢復(fù)，4只觸須活動(dòng)部分恢復(fù)，但閉眼不全，所有大鼠鼻尖歪斜無(wú)恢復(fù)。

對(duì)照組術(shù)后3 d左側(cè)角膜反射消失，觸須無(wú)活動(dòng)，鼻尖向右側(cè)歪斜；術(shù)后7 d有6只大鼠出現(xiàn)輕微角膜反射，但閉眼不全，6只觸須活動(dòng)部分恢復(fù)，2只鼻尖恢復(fù)居中；術(shù)后21 d有3只大鼠角膜反射完全恢復(fù)，6只大鼠出現(xiàn)輕微角膜反射，6只觸須活動(dòng)完全恢復(fù)，3只觸須活動(dòng)部分恢復(fù)，但閉眼不全，4只鼻尖恢復(fù)居中。

空白組均無(wú)面癱表現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組面神經(jīng)功能隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸恢復(fù)。但實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)速度較對(duì)照組緩慢（表1）。

2.2 電生理檢測(cè)

對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組隨時(shí)間延長(zhǎng)，口輪匝肌復(fù)合動(dòng)作電位最大波幅和潛伏期逐漸接近空白組水平；組間兩兩比較，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組術(shù)后3 d、7 d和21 d口輪匝肌復(fù)合動(dòng)作電位最大波幅均低于空白組，潛伏期長(zhǎng)于空白組（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3 d、7 d和21 d口輪匝肌復(fù)合動(dòng)作電位最大波幅低于對(duì)照組，潛伏期長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05），差異明顯（表2）。

2.3 組織學(xué)觀察

2.3.1 HE染色

術(shù)后第3天，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組軸突均出現(xiàn)明顯腫脹扭曲，實(shí)驗(yàn)組腫脹更為明顯，呈臘腸樣，基底膜腔腫脹，呈串珠狀?？瞻捉M面神經(jīng)纖維排列緊密規(guī)則，軸突明顯，髓鞘無(wú)腫脹及退變（圖1）。

術(shù)后第5天，實(shí)驗(yàn)組軸突腫脹加劇，部分崩解消失，髓鞘不連續(xù)或已消失成空泡狀，對(duì)照組神經(jīng)纖維情況與實(shí)驗(yàn)組相似，但變性明顯較實(shí)驗(yàn)組輕（圖2）。

術(shù)后第7天，實(shí)驗(yàn)組大量神經(jīng)纖維崩解壞死，神經(jīng)結(jié)構(gòu)紊亂，部分神經(jīng)內(nèi)膜連續(xù)性好，遺留神經(jīng)纖維壞死輪廓。對(duì)照組腫脹消退，逐漸恢復(fù)正常（圖3）。

2.3.2 S-100蛋白免疫組織化學(xué)染色

術(shù)后第3天，S-100累積光密度（IOD）值分別為：實(shí)驗(yàn)組（0.317±0.004），對(duì)照組（0.317±0.008），空白組（0.316±0.005），三組間無(wú)明顯差異（圖4）。

術(shù)后第5天，實(shí)驗(yàn)組（0.581±0.002），對(duì)照組（0.633±0.008），空白組（0.317±0.002）。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均高于空白組，而對(duì)照組則高于實(shí)驗(yàn)組，差異明顯（圖5）。

術(shù)后第7天，實(shí)驗(yàn)組（0.385±0.001），對(duì)照組（0.635±0.003），空白組（0.316±0.007），數(shù)據(jù)顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均高于空白組，對(duì)照組則高于實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6）。

術(shù)后3 d、5 d和7 d空白組雪旺細(xì)胞改變無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后3 d，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組雪旺細(xì)胞均開(kāi)始增殖；術(shù)后5 d，兩組達(dá)到增殖高峰；術(shù)后7 d實(shí)驗(yàn)組雪旺細(xì)胞開(kāi)始明顯減少，對(duì)照組則維持峰值（圖7）。

表1 各組術(shù)后3 d、7 d和21 d面神經(jīng)功能不同分度的大鼠數(shù)目Table1 The degree of facial nerve function at 3,7,21 days after operation

表2 口輪匝肌復(fù)合動(dòng)作電位最大波幅和潛伏期(x+s)Table2 The maximum amplitude and latency of Orbicularis oris muscle compound action potential(x+s)

圖1 術(shù)后3 d HE染色（400×）Fig.1 HE staining at 3 day after operation(400×)

圖2 術(shù)后5 d HE染色（400×）Fig.2 HE staining at 5 day after operation(400×)

圖3 術(shù)后7 d HE染色（400×）Fig.3 HE staining at 7 day after operation(400×)

圖4 術(shù)后3 d S-100表達(dá)情況（400×）Fig.4 S-100 expression at 3 day after operation(400×)

圖5 術(shù)后5 d S-100表達(dá)情況（400×）Fig.5 S-100 expression at 5 day after operation(400×)

圖6 術(shù)后7 d S-100表達(dá)情況（400×）Fig.6 S-100 expression at 7 day after operation(400×)

圖7 各組S-100變化趨勢(shì)Fig.7 Change trend of S-100

3 討論

近年來(lái)，外傷性面神經(jīng)損傷的患者逐年增加，外傷性面神經(jīng)損傷可導(dǎo)致嚴(yán)重面癱，給患者造成極大的生理和心理負(fù)擔(dān)。顱面復(fù)合外傷導(dǎo)致面神經(jīng)損傷，大體可分外力直接損傷和間接損傷，后者尤以顱底骨折伴發(fā)面癱為最典型代表。從解剖學(xué)上看，面神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)血管位于外膜內(nèi)，分支形成微動(dòng)脈，并透過(guò)神經(jīng)束膜在神經(jīng)束內(nèi)構(gòu)成毛細(xì)血管[7]，當(dāng)顱底骨折時(shí)，面神經(jīng)管內(nèi)的面神經(jīng)受到骨折碎片卡壓，局部缺血，神經(jīng)發(fā)生水腫，導(dǎo)致管內(nèi)壓增高，升高的壓力加重血管壓迫，造成神經(jīng)嚴(yán)重缺血，神經(jīng)功能喪失。

面神經(jīng)屬于外周神經(jīng)，其損傷后的修復(fù)和再生涉及一系列的細(xì)胞和分子生物學(xué)的改變。損傷后，受損部位近心端軸突膜封閉，防止軸漿持續(xù)外溢，大量Ca2+內(nèi)流，并誘導(dǎo)受損軸突轉(zhuǎn)為再生狀態(tài)[8]；遠(yuǎn)心端發(fā)生華勒氏變性，軸索和髓鞘變性壞死，形成碎片；局部雪旺細(xì)胞活化增生，在吞噬碎片的同時(shí)，釋放巨噬細(xì)胞趨化因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)和表面黏著分子等，誘導(dǎo)大量巨噬細(xì)胞聚集并移除軸突和髓鞘破損碎片。同時(shí)，雪旺細(xì)胞增生，形成Bungner′s帶，為近端軸突再生進(jìn)入遠(yuǎn)端提供合適的環(huán)境；增生的雪旺細(xì)胞分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子、軸突生長(zhǎng)因子、層黏連蛋白、纖連蛋白等，促進(jìn)近端軸突的再生[9]。由此可見(jiàn)，在整個(gè)神經(jīng)損傷再生過(guò)程中，雪旺細(xì)胞是非常重要的。大量研究證實(shí)，在神經(jīng)損傷早期，抑制雪旺細(xì)胞的增殖會(huì)明顯阻礙神經(jīng)的修復(fù)。但雪旺細(xì)胞逆向分化、增生、吞噬和分泌是一個(gè)耗能過(guò)程。我們前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，在神經(jīng)損傷的早期，局部血流量增加，到晚期局部血流量才恢復(fù)到正常[10]。Hoke等[1]認(rèn)為，血流量的增加是因局部華勒氏變性和細(xì)胞增殖而出現(xiàn)，是神經(jīng)再生的重要過(guò)程，充足的血供是神經(jīng)再生的必要條件。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了面神經(jīng)損傷伴缺血及面神經(jīng)單純損傷的對(duì)比模型。通過(guò)行為學(xué)觀察及電生理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，損傷伴缺血和單純損傷都會(huì)損害面神經(jīng)，造成面癱。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組面神經(jīng)功能都在逐漸恢復(fù)，但是損傷伴缺血組面神經(jīng)恢復(fù)速度緩慢。

免疫組織化學(xué)染色觀察發(fā)現(xiàn)，單純損傷組術(shù)后3 d S-100陽(yáng)性率并無(wú)明顯增加，術(shù)后5 d S-100陽(yáng)性率明顯增加，術(shù)后7 d S-100陽(yáng)性率較第5天無(wú)明顯增高。這與經(jīng)典華勒變性過(guò)程中雪旺細(xì)胞的增殖一致。大量相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)損傷后48 h內(nèi)，雪旺細(xì)胞開(kāi)始大量增殖，4 d后達(dá)到高峰。損傷伴缺血組術(shù)后3 d S-100陽(yáng)性率無(wú)明顯增加，術(shù)后5 d S-100陽(yáng)性率顯著增加，但較單純損傷組低，而術(shù)后7 d S-100陽(yáng)性率明顯下降。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)損傷后的華勒氏變性及再生過(guò)程中，雪旺細(xì)胞代謝明顯增強(qiáng)，對(duì)能量的需求大量增加。而華勒氏變性過(guò)程中，局部缺血會(huì)導(dǎo)致雪旺細(xì)胞的能量供給發(fā)生障礙，導(dǎo)致雪旺細(xì)胞去分化及增殖緩慢，Bungner′s帶形成延遲[11-12]。提示損傷伴缺血組雪旺細(xì)胞增殖異常及功能恢復(fù)緩慢的原因，可能是由于局部缺血導(dǎo)致雪旺細(xì)胞能量供給障礙，從而導(dǎo)致雪旺細(xì)胞去分化及增殖緩慢，Bungner′s帶形成延遲，進(jìn)一步延緩了神經(jīng)功能的恢復(fù)。缺血影響雪旺細(xì)胞去分化及增殖的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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The Impact of Ischemic on the Proliferation of Schwann Cells after Facial Nerve Injury

WANG Zhixing,OUYANG Huoniu,CHENG Zhihua,GUO Zhilin.Neurosurgical Department,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:GUO Zhilin(E-mail:gzlysr@126.com).

ObjectiveTo observe the proliferation of Schwann cells after facial nerve injury associated with ischemia and to find the new insight for the clinical treatment of skull base fractures with facial nerve injury.MethodsSeventy-five male SD rats were divided into 3 groups：control group(n=30),experimental group(n=30)and blank group(n=15).Left facial nerve trunks were selected in 3 groups.The control group accepted crush injury only;the experimental group accepted crush injury and stripped of blood vessels around epineurium under microscope;the blank group served as sham group.Twenty-five rats received behavioral observation and electrophysiological testing 3,7 and 21 days after the operation;The remaining 50 rats were killed 3,5 and 7 days after operation respectively,the obtained specimens were stained by S-100,and observed by immunohistochemical staining analysis.ResultsElectrophysiological testing and behavioral analysis showed no facial paralysis performance in blank group;The experimental and control group showed facial paralysis performance,and with the prolongation of time the two groups have a recovery performance.However,the recovery rate of the experimental group was significantly slower.Immunohistochemistry showed the Schwann cells had no significant change among 3,5 and 7 days after operation in blank group;The Schwann cells of the experimental and control group began to proliferate 3 days the operation, the two groups reached the peak of proliferation 5 days the operation;The Schwann cells significantly reduced in experimental group 7 days the operation,while no significant change was observed in control group.ConclusionCrush associated with ischemia could reduce the proliferation of Schwann cells and hinder the recovery of facial nerve.

Rat;Facial nerve;Injury;Ischemia;Proliferation

Q813.1+1

A

1673－0364（2013）02－0093－06

2013年1月8日；

2013年3月16日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.008

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院神經(jīng)外科。

郭智霖（Email：gzlysr@126.com）。