屈 悅 鄧辰亮 萬偉東 茅廣宇 丁 志 楊 松 林 鄭江紅

人皮膚成纖維細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染Brg1基因的實(shí)驗(yàn)研究

屈 悅 鄧辰亮 萬偉東 茅廣宇 丁 志 楊 松 林 鄭江紅

目的探討重組Brg1基因轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞的可行性，以及轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖和活性的影響。方法體外重組Brg1基因，借助真核表達(dá)載體系統(tǒng)，轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞；通過流式細(xì)胞儀檢測報(bào)告基因表達(dá)，并確定細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；應(yīng)用Realtime PCR比較轉(zhuǎn)染前后Brg1 mRNA的表達(dá)；MTT法檢測Brg1基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果Brg1基因轉(zhuǎn)染后，（73.0±6.7）%的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因；Brg1 mRNA在轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)分別為（6.23±1.18）、（1.11±0.22）和（1.52±0.12），轉(zhuǎn)染組Brg1 mRNA相對表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空載體組明顯增高（P＜0.01）；細(xì)胞的增殖能力在Brg1基因轉(zhuǎn)染前后無顯著差異。結(jié)論人皮膚成纖維細(xì)胞可作為Brg1轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)染Brg1基因?qū)θ顺衫w維細(xì)胞的增殖能力無顯著影響。

染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物核心催化亞基轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞

2010年，Singhal等[1-2]發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物核心催化亞基（Brahma-related gene 1，Brg1）參與ATP介導(dǎo)的染色質(zhì)重塑過程，與蛋白質(zhì)Baf155和Ini1聯(lián)合可大大提高體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的效率。大量研究顯示，Brg1能與多種蛋白質(zhì)結(jié)合并相互作用，參與DNA復(fù)制和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、基因重組等過程，在細(xì)胞的增殖、分化、衰老和凋亡中發(fā)揮重要作用[3-8]，因此Brg1具有非常重要的應(yīng)用意義。本實(shí)驗(yàn)旨在探討重組Brg1基因轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞的可行性，以及轉(zhuǎn)染Brg1基因?qū)?xì)胞增殖的影響，為進(jìn)一步探究iPS細(xì)胞對人成纖維細(xì)胞的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

0.25%DispaseⅡ酶、DMEM培養(yǎng)基、T4DNA連接酶、Trizol試劑盒（Gibco公司，美國）；TaKa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶PCR試劑盒、DNA Marker、6×loading buffer、SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，日本）；膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5α、DNA連接試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）；PCR引物、pcDNA3.1-GFP載體、Brg1 cDNA片段（生工生物工程股份有限公司）；限制性內(nèi)切酶EcoRI、XbaI（大連寶生物工程有限公司）；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美國）；胎牛血清FBS（Hyclone公司，美國）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma，美國）；二甲基亞砜（Sigma，美國）。

1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及目的基因PCR擴(kuò)增

根據(jù)人Brg1基因組序列，設(shè)計(jì)上下游引物。為保證干擾效果，在引物上、下游分別引入EcoRI和XbaI內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)（下劃線處）。Full length-F：5'-CGGAATTCAAGGGAGCAGGCTCAGAGTG3'，F(xiàn)ull length-R：5'-GCTTCAGATGACGGAAGGAAGAGCCGA-3'。引物合成后，利用購得的Brg1 cDNA按Taq酶試劑盒操作說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。目的基因長度為3 500 bp。將產(chǎn)物凝膠電泳分離后，切膠回收、純化Brg1片段。

1.2.2 Brg1真核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

將PCR純化產(chǎn)物與pcDNA3.1-GFP質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI進(jìn)行雙酶切后，凝膠電泳、純化回收酶切產(chǎn)物。經(jīng)T4DNA連接酶16℃過夜連接后，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆擴(kuò)增后，提取轉(zhuǎn)染成功的pcDNA3.1-Brg1-GFP質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，電泳鑒定。

1.3 細(xì)胞提取

標(biāo)本來源于上海第六人民醫(yī)院整形外科門診患者的上瞼皮膚，獲患者知情同意。于無菌條件下切取，置于含有青霉素（100 000 U/L）和鏈霉素（100 mg/L）的PBS中，浸泡30 min后移至培養(yǎng)皿，剔除皮下組織，剪成小條狀，以0.25%DispaseⅡ酶4℃過夜消化。揭下表皮，將分離的真皮剪碎至1～2 mm3大小，37℃搖床消化3 h，150目濾網(wǎng)收集過濾液，1 500 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，按2×104cells/cm2接種于培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 h后更換培養(yǎng)液，以后3 d換一次液，第3天鏡下觀察成纖維細(xì)胞游離出，并能順利傳代視為培養(yǎng)成功。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

轉(zhuǎn)染前一天，將第3代細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于2個(gè)培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。分別取2組無血清DMEM培養(yǎng)液240 μL與10 μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000混合，另取2組240 μL DMEM培養(yǎng)液分別與10 μL（100 pmol）pcDNA3.1-GFP和10 μL（100 pmol）pcDNA3.1-Brg1-GFP質(zhì)?；靹?，5 min后分別將脂質(zhì)體和兩種質(zhì)粒液合并，室溫下放置20 min；吸掉培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液，以每管1.5 mL加無血清DMEM培養(yǎng)基，再分別加入2組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染液，37℃培養(yǎng)5 h后，棄轉(zhuǎn)染液，換10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞分組：未轉(zhuǎn)染正常組、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1-GFP組和pcDNA3.1-Brg1-GFP轉(zhuǎn)染組。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的檢測

當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長48 h時(shí)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況；收集、離心并調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×106（體積1 mL細(xì)胞懸液），同樣收集未轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及空載體細(xì)胞至同樣體積與濃度，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析和檢測。

1.6 Realtime PCR檢測Brg1基因的表達(dá)

當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染2 d后，分別收集未轉(zhuǎn)染正常組、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1-GFP和Brg1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量后，按TaKaLa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)人Brg1基因序列，設(shè)計(jì)上、下游引物序列。Brg1-F：5'-TTGACTACAGGCTCGTGGCT-3'，Brg1-R：5'-GGTATCATGAGTACCCGGTT-3'。將3組產(chǎn)物及合成的引物行Realtime PCR反應(yīng)，具體步驟按SYBR Premix Ex TaqTM使用說明書操作。

1.7 MTT法檢測Brg1轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖能力的影響

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定每孔細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)。轉(zhuǎn)染24 h后，分別收集未轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1-GFP和Brg1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔，以每孔1×105細(xì)胞濃度接種于96孔板。在避光環(huán)境下，取每組第1個(gè)復(fù)孔加入濃度為5 mg/mL的MTT液20 μL，孵育4 h后棄上清液，加入150 μL DMSO，置于恒溫振蕩箱內(nèi)振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀測定各組在490 nm波長處的吸光度值（OD值），每組的其余復(fù)孔分別于轉(zhuǎn)染后第2、3、4、5天重復(fù)上述操作步驟。

以各組細(xì)胞培養(yǎng)的天數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Brg1基因表達(dá)載體構(gòu)建的檢測

重組pcDNA3.1-Brg1-GFP質(zhì)粒用EcoRI和XbaI雙酶切后電泳，在同一泳道中出現(xiàn)2條DNA帶，1條帶在5 000～7 500 bp之間，與酶切后的空載體pcDNA3.1-GFP DNA鏈長度相符，確定為質(zhì)粒DNA帶；另1條帶在2 500～5 000 bp之間，與目的基因片段大小相符；空載體pcDNA3.1-GFP經(jīng)相同雙酶切后電泳僅見5 000～7 500 bp之間的1個(gè)條帶（圖1）。這表明已成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體。

圖1pcDNA3.1-Brg1-GFP質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果Fig.1The restriction endonuclease result of pcDNA3.1-Brg1-GFP

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果

2.2.1 綠色熒光蛋白的表達(dá)

成纖維細(xì)胞被轉(zhuǎn)染48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)（圖2）。

圖2Brg1轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白的表達(dá)Fig.2The expression of green fluorescent protein after Brg1 transfection

2.2.2 流式細(xì)胞儀分析

成纖維細(xì)胞被轉(zhuǎn)染48 h后，（73.0±6.7）%的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因熒光（圖3）。

圖3Brg1轉(zhuǎn)染后流式細(xì)胞儀分析Fig.3The flow cytometric analysis after Brg1 transfection

2.3Realtime PCR檢測Brg1基因表達(dá)

轉(zhuǎn)染24 h后，Realtime PCR檢測到Brg1基因在轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)分別為（6.23±1.18）、（1.11±0.22）和（1.52±0.12），轉(zhuǎn)染組Brg1 mRNA相對表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組明顯增高（n＝5，P＜0.01），而未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（n＝5，P＞0.05）（圖4）。

圖4Brg1 mRNA在轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.4Brg1 mRNA expression in transfected cell group, empty-vector cell group or un-transfected cell group

2.4MTT法檢測Brg1轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖能力的影響

MTT法顯示，隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖數(shù)量增加，在細(xì)胞培養(yǎng)的第2～4天，細(xì)胞增殖速度最快，第4天后，細(xì)胞增殖能力趨向穩(wěn)定。細(xì)胞的增殖能力在Brg1轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組無顯著性差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5Brg1轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力Fig.5The cell proliferation curve of Brg1 transfected cell group,empty-vector cell group or un-transfected cell group

3 討論

Yarnanaka等[9]應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒將小鼠成纖維母細(xì)胞重編程為具有多分化潛能的干細(xì)胞，命名為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPS細(xì)胞）。該技術(shù)使得將同一個(gè)體易獲得的體細(xì)胞變成具有多向分化潛能的干細(xì)胞成為可能，避免了異體移植產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)，也避免了長期困擾胚胎干細(xì)胞研究的倫理問題[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，Brg1參與ATP介導(dǎo)的染色質(zhì)重塑過程，與蛋白質(zhì)Baf155和Ini1聯(lián)合可將體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的效率提高至4.5%，遠(yuǎn)高于以往的文獻(xiàn)報(bào)道，大大加快了成體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的研究進(jìn)程。

Brg1作為SWI/SNF復(fù)合物的一種核心酶，在多種細(xì)胞因子的協(xié)調(diào)作用及復(fù)雜機(jī)制下，可與多種蛋白質(zhì)結(jié)合并相互作用，參與DNA復(fù)制和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)等過程，影響細(xì)胞的增殖、分化、癌變、衰老和凋亡。但是目前關(guān)于Brg1基因作用的研究主要集中在血管發(fā)生、內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)及胚胎器官發(fā)生等方面，Brg1轉(zhuǎn)染人體成纖維細(xì)胞的研究還未曾有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)為探明Brg1轉(zhuǎn)染人體皮膚成纖維細(xì)胞的可行性，及對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖和活性的影響，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，也為進(jìn)一步研究iPS細(xì)胞及其他方面的研究奠定重要的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)中，重組的Brg1基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染的Brg1轉(zhuǎn)錄因子在成纖維細(xì)胞中的有效表達(dá)，是判斷Brg1基因轉(zhuǎn)染成功與否的關(guān)鍵。我們將流式細(xì)胞儀觀察與相對精確的Realtime PCR方法相結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（73.0±6.7）%的細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因，而且轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞Brg1 mRNA表達(dá)明顯高于對照細(xì)胞，提示Brg1基因已成功轉(zhuǎn)入。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，當(dāng)人皮膚成纖維細(xì)胞被導(dǎo)入Brg1基因后，與未轉(zhuǎn)染Brg1基因?qū)φ战M相比，細(xì)胞的增殖活性未見顯著性差異。雖然Brg1作為染色質(zhì)重塑復(fù)合物的核心酶，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，但決定細(xì)胞增殖的因素很多，且需要其他細(xì)胞因子的共同參與，如Brg1與蛋白質(zhì)Baf155和Ini1聯(lián)合可大大提高體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的效率[1]。同時(shí)Brg1是一種重要的抑癌基因，此前已有大量研究證實(shí)，Brgl基因在卵巢癌、宮頸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在肺癌組織及其它多種腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)或缺失[12-16]。細(xì)胞惡變是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)、多階段、復(fù)雜漸進(jìn)的過程，可能與啟動子異常甲基化、基因突變及其轉(zhuǎn)錄激活功能異常等因素有關(guān)；同時(shí)，Brg1在不同來源組織間表達(dá)及作用的差異可能反映其具有組織/細(xì)胞特異性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了人體皮膚成纖維細(xì)胞可作為Brg1轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)染組Brg1基因后對人成纖維細(xì)胞的增殖及活性未見顯著影響。但體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否完全一致，Brg1轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后在體內(nèi)的具體情況如何，還有待于進(jìn)一步研究。

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Transfection of Recombinant Brg1 Gene into Human Skin Fibroblasts in Vitro

QU Yue,DENG Chenliang,WAN Weidong,MAO Guangyu,DING Zhi,YANG Songlin,ZHENG Jianghong.Department of Plastic Surgery,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200233,China.Corresponding author:ZHENG Jianghong(E-mail:zjhsh68@sohu.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of transfecting recombinant Brg1 into human skin fibroblasts and to investigate the impact on cell proliferation rate and activity.MethodsRecombinant human Brg1 was transfected into skin fibroblasts by the karyocyte expressive vector.The cell transfection efficiency was determined through testing reported gene expression by flow cytometry;The expression of Brg1 mRNA before and after transfection was quantified by Realtime PCR; MTT was used to detect cell proliferation before and after transfection.ResultsThe cell transfection efficiency of human skin fibroblasts was nearly(73.0±6.7)%;The relative expression level of Brg1 mRNA in transfected cell group,empty-vector cell group or un-transfected cell group were respectively 6.23±1.18,1.11±0.22 and 1.52±0.12.The level of mRNA in transfected cell group was significantly higher compared with either un-transfected cell group or empty-vector cell group(P＜0.01); The proliferation abilities had no significant difference before and after transfection.ConclusionThe human skin fibroblasts can be used as the target cells of Brg1 gene transfection,which has no significant impact on fibroblast proliferation.

Brahma-related gene 1;Transfection;Human skin fibroblasts;Induced pluripotent stem cells

Q786

A

1673－0364（2013）02－0089－04

2013年1月14日；

2013年3月3日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.007

國家自然科學(xué)基金（81000837）。

200233上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院整形外科。

鄭江紅（E-mail：zjhsh68@sohu.com）。