馬 迪 嚴佶祺 彭承宏 施敏敏 傅文祎 王維杰 李宏為

構建攜帶hTERT基因的慢病毒重組載體及其包裝和表達

馬 迪 嚴佶祺 彭承宏 施敏敏 傅文祎 王維杰 李宏為

目的構建含hTERT基因的慢病毒重組載體，進行病毒包裝并檢測hTERT在293T細胞中的表達。方法PCR擴增hTERT，插入慢病毒載體，并與包裝質粒轉染293T細胞，進行病毒包裝，并測定其滴度。Western-Blot檢測慢病毒液感染293T細胞后hTERT的表達。結果成功構建了含hTERT的慢病毒重組載體，滴度為2.79×107Tu/mL，Western-Blot檢測顯示慢病毒液感染的293T細胞中hTERT基因高表達。結論含hTERT的慢病毒重組載體成功構建并包裝后能夠順利感染293T細胞，并陽性表達目的基因。

人端粒酶逆轉錄酶慢病毒重組載體

骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）是存在于骨髓內的一種具有多向分化潛能和自我更新能力的細胞，一定條件下可經誘導定向分化為骨、軟骨、肌腱等細胞系。作為組織工程理想的種子細胞，BMSCs已成為研究熱點[1-2]，并展現(xiàn)出廣泛的應用前景[3]。但是，BMSC與機體其他細胞一樣也具有Hayflick界限，隨著細胞的分裂增殖次數(shù)增多而伴隨出現(xiàn)的衰老現(xiàn)象，不僅會降低分裂能力，也會影響其多向分化潛能。

人端粒酶逆轉錄酶（Human telomerase reverse transcriptase，hTERT）決定著端粒酶活性。研究表明，外源性表達hTERT可以提高細胞端粒酶活性，使其增殖分裂能力增強，并賦予細胞抗衰老甚至永生化的能力[4-5]。本實驗嘗試構建攜帶hTERT基因的重組慢病毒表達載體，并進行包裝、滴度測定和感染293T細胞后的鑒定，進一步利用基因工程技術改造BMSC，增加細胞的分裂增殖能力、延長細胞壽命，為組織工程種子細胞的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

慢病毒表達載體3D-LV-OE-018EG及其包裝質粒（上海思路迪生物技術有限公司）；包含hTERT全長的質粒GC-Q0450（廣州復能基因有限公司）；293T細胞（ATCC）；KOD-Plus（TOYOBO公司）；限制性內切酶XbaI（寶生物工程有限公司）；限制性內切酶BstBI（NEB公司）；Lipofectamine 2000（Life Technologies Corporation）；蛋白濃度測定試劑盒（PIERCE公司）；小鼠抗人FLAG一抗（SIGMA）；HRP標記二抗（上海康成生物工程公司）；polybrene（SIGMA）；RIPA裂解液、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒（碧云天生物有限公司）；濾紙（BIO-RAD公司）；PCR儀（BIO-RAD公司）；電泳儀（BIO-RAD公司）；凝膠成像儀（Amersham Biosciences公司）；電轉儀（BIO-RAD公司）；其余試劑為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 含hTERT的質粒PCR擴增

GenBank上查hTERT基因序列（NM_198253.2），設計引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成，并進行PCR擴增（94℃預變性2 min；94℃變性15 sec，56℃退火30 sec，68℃延伸1 min，共25個循環(huán)；68℃延伸9 min）。PRIMER F：ctagTCTAGAccgcgcgctccccgctg；PRIMER R：gccTTCGAAgtccaggatggtcttgaagtctgagggc。引物中TCTAGA及TTCGAA分別表示限制性內切酶XbaI和BstBI序列。PCR體系為50 μL體系，含質粒0.2 μL，上下游引物各1.5 μL，10×Kod plus buffer 5 μL，Kod plus 1 μL。

1.2.2PCR擴增產物以及慢病毒載體的酶切回收、連接及鑒定

利用限制性內切酶XbaI和BstBI對含hTERT的PCR擴增產物以及慢病毒載體（慢病毒載體的完整元件為EF1α-MCS-FLAG-P2A-copGFP）進行雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳獲得相應目的條帶，按瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說明進行酶切產物膠純化回收。在T4DNA連接酶的作用下對含hTERT的目的片段以及慢病毒載體片段進行連接，并將連接產物轉化TOP10感受態(tài)細胞進行擴大培養(yǎng)，挑取LB培養(yǎng)基中繼續(xù)生長的陽性菌落，再次通過雙酶切及凝膠電泳鑒定是否正確，將鑒定正確的質粒命名為TERT/3D-LV-OE-018EG，并送華大基因檢測確定基因序列的正確性。

1.2.3 重組慢病毒質粒轉染293T細胞

選擇處于對數(shù)生長期、狀態(tài)佳的293T細胞于轉染前1天，進行胰酶消化，細胞計數(shù)后以10% FBS+DMEM培養(yǎng)基調整細胞數(shù)量并接種于100 mm培養(yǎng)平皿中，使細胞數(shù)達到3×106個/皿。將測序鑒定正確的重組質粒抽提后，制備質粒DNA，觀察細胞狀態(tài)，當細胞達到70%~80%融合時進行重組質粒轉染。

按照Lipofectamine 2000說明書進行轉染，將293T細胞上清換為無血清培養(yǎng)基，同時制備Lipofectamine 2000+無血清培養(yǎng)基的混合液和重組質粒+無血清培養(yǎng)基混合物，各自室溫孵育5 min，小心混勻兩種混合物，室溫孵育20 min后緩慢加入培養(yǎng)皿中，使之與細胞混合均勻，8 h后換為含血清的完全培養(yǎng)基；48 h后，熒光顯微鏡下觀察GFP表達，計算轉染效率，空病毒質粒轉染293T細胞作為對照組。

1.2.4 重組慢病毒的包裝及滴度測定

慢病毒質粒DNA總量為12 μg（包含重組慢病毒表達質粒及包裝輔助質粒3D LV Packaging Mix），轉染試劑Lipofectamine 2000為24 μL，各以無血清培養(yǎng)基稀釋調整總體積為500 μL，室溫下孵育5 min。混合以上兩種液體，室溫孵育20 min，將混合液轉移至293T細胞培養(yǎng)皿中，充分混勻后放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 h后更換為含血清的完全培養(yǎng)基；轉染48 h及72 h后，分別收集293T細胞上清液。Millex-HV 0.45 μm濾膜過濾純化病毒上清液，4℃下20 000 r/min，超速離心2 h濃縮病毒，DMEM 200 μL重懸后，20 μL每EP管分裝，-80℃保存，留取其中一管以備滴度測定。

滴度測定前1天，常規(guī)胰酶消化293T細胞并計數(shù)，調整細胞數(shù)為2×105cells/mL，并接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔為100 μL。接種后第2天，留取數(shù)個無菌EP管，將病毒原液10 μL加入第1管內，并加入90 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，充分混勻后吸取10 μL液體加入第2管內，并同樣加入90 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，以此類推，倍比稀釋慢病毒濃縮液（各EP管內病毒原液分別為10 μL、1 μL、10-1μL、10-2μL、10-3μL、10-4μL）。選取待測孔，各孔內加入以上不同稀釋梯度的病毒液10 μL，加入polybrene并調整至終濃度為8 μg/mL，于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h后熒光顯微鏡觀察GFP表達情況，并計算病毒滴度[6-7]。

1.2.5 重組慢病毒液感染293T細胞及Western－Blot驗證hTERT蛋白表達水平

取包裝后的重組慢病毒液感染293T細胞，感染48 h后收集細胞標本，抽提細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，確定上樣體積，PCR儀內100℃蛋白熱變性后進行SDS-PAGE電泳分離，轉膜、封閉及添加抗FLAG一抗及HRP標記二抗，ECL法發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)中掃描成像，讀取并分析計算各個條帶的灰度值，重復3次，空載病毒液感染組作為對照。

2 結果

2.1 構建攜帶hTERT基因的慢病毒重組表達載體

通過限制性內切酶XbaI及BstBI雙酶切，慢病毒重組質粒酶切產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳后，成像、攝片，可得到2條高亮條帶，分別是慢病毒載體的線性化片段與hTERT目的基因片段（3.5 Kb）。同時將重組慢病毒質粒送檢測序，結果提示插入片段與質粒GC-Q0450中hTERT基因序列一致（圖1）。

圖1 慢病毒重組載體XbaI及BstBI雙酶切凝膠電泳鑒定Fig.1 Identification of recombinant vector by using restriction endonuclease XbaI and BstBI

2.2 重組慢病毒質粒轉染293T細胞

重組質粒轉染293T細胞48 h后，重組慢病毒組與空載病毒組均于熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達，表明重組質粒已成功構建并成功轉染293T細胞（圖2）。

2.3 重組慢病毒液的滴度測定

熒光顯微鏡觀察顯示，熒光細胞數(shù)目隨著病毒液的稀釋倍數(shù)增加而逐步減少，按逐孔稀釋滴度測定法測定其滴度為2.79×107Tu/mL。

2.4 重組慢病毒液感染293T細胞后hTERT蛋白水平的檢測

重組慢病毒液及空載慢病毒液感染293T細胞后，Western－Blot檢測顯示，重組慢病毒組有FLAG標簽蛋白的表達，而空載體組未見有FLAG標簽蛋白的相關表達。由于目的基因hTERT已與FLAG標簽蛋白融合，結果充分說明經包裝后的重組慢病毒液能夠成功感染293T細胞，并在293T細胞內成功表達目的基因（圖3）。

圖2 重組慢病毒質粒（A）及空載病毒質粒轉染293T細胞（B）熒光蛋白表達情況(100×)Fig.2 The fluorescence microscopy image of 293T cells transfected with recombinant plasmid(A)and 3D-LV-OE-018EG(B)(100×)

圖3 Western-Blot檢測空載病毒液與重組慢病毒液感染293T細胞后FLAG標簽蛋白的表達Fig.3The expression of FLAG in 293T cells infected by recombinant virus supernatant and empty virus supernatant by Western-Blot

3 討論

選用合適的目的基因對種子細胞進行基因改造，使其能克服生存界限，獲得更強大的分裂增殖能力，甚至進一步成為永生化細胞株，是組織工程種子細胞研究中新的課題。有研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶作為一種核糖核蛋白復合體，在維持細胞壽命方面具有重要作用[8]，通過誘導端粒酶的產生可維持端粒的長度，從而延長細胞壽命。而端粒酶的活性主要由端粒酶逆轉錄酶（Telomerase reverse transcriptase，TERT）決定。本研究選用的目的基因hTERT，已被多項研究證明，其外源性的輸入可以提高端粒酶的活性并延長細胞壽命[9-10]。作為構建永生化細胞系的常用方法之一，以SV40為首的病毒癌基因介導的永生細胞株的構建過程中，可能存在成瘤隱患和病毒感染的危險；hTERT介導的細胞永生化的安全性相對更高，致瘤風險更低。

選擇合適的載體將目的基因有效轉移進入靶細胞，并在靶細胞內長期穩(wěn)定表達、執(zhí)行相關作用，是基因治療中非常重要的一個環(huán)節(jié)。目前常見的載體大致可分為病毒類載體和非病毒類載體。由于轉染效率過低，非病毒類載體的應用受到了限制，而病毒類載體中的逆轉錄病毒載體和腺病毒載體雖已具備了真核表達載體無法比擬的優(yōu)勢，但因無法感染非分裂期細胞[11]、容易誘發(fā)機體免疫毒性反應和目的基因表達不穩(wěn)定[12]，使其應用受到限制?？紤]到基因治療的最終目的，本實驗選用了改進的慢病毒載體表達系統(tǒng)3D-LV-OE-018EG，相較于早期構建的HIV-I型慢病毒載體，具有更高的安全性和有效性，對于后期動物實驗中安全無成瘤危險的要求提供了充分的保障。而慢病毒載體本身所具備的感染非分裂及終末分化細胞能力[13]、高轉染效率、可容納大片段外源目的基因等優(yōu)勢，也使其在各類原代細胞以及干細胞的研究應用中展現(xiàn)出了不小的潛力。

本實驗中，我們通過PCR方法對目的基因進行擴增，并使其定向連接到目的載體上，結合酶切電泳以及測序鑒定結果，順利克隆了目的基因的編碼區(qū)序列，并利用慢病毒載體作為基因載體，成功構建了含有目的基因的慢病毒表達載體TERT/3D-LVOE-018EG。經過包裝后獲得了高滴度的重組慢病毒液，感染293T細胞后檢測到目的基因在蛋白水平的高表達，表明了重組慢病毒液不僅能在293T細胞中正常工作并且能夠表達目的基因蛋白，為今后的進一步研究奠定了基礎。

[1]周栩,周廣東,張路,等.不同體外誘導時間對BMSCs成軟骨分化的組織學特性影響的研究[J].組織工程與重建外科,2011,7(2)：70-74.

[2]李佳濱,張文杰,崔福齋,等.P17-BMP2多肽促進大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的實驗研究[J].組織工程與重建外科,2012,8 (2)：65-68.

[3]馬迪,嚴佶祺,張明鈞,等.骨髓間充質干細胞促進大鼠小體積肝移植后肝再生的實驗研究[J].肝膽外科雜志,2012,20(4)：301-303.

[4]Li NF,Broad S,Lu YJ,et a1.Human ovarian surface epithelial cells immortalized with hTERT maintain functional pRb and p53 expression[J].Cell Prolif,2007,40(5)：780-794.

[5]Yuan J,Yang BM,Zhong ZH,et a1.Up regulation of survivin duringimmortalizationofnontransformedhumanfibroblasts transduced with telomerase reverse transcriptase[J].Oncogene, 2009,28(29)：2678-2689.

[6]LaBarre DD,Lowy RJ.Improvements in methods for calculating virus titer estimates from TCID50 and plaque assays[J].J Virol Methods,2001,96(2)：107-126.

[7]Nauta JJ,de Brujin IA.On the bias in HIV titers and how to reduce it[J].Vaccine,2006,24(46)：6645-6646.

[8]Ju Z,Rudolph KL.Telomeres and telomerase in stem cells during aging and disease[J].Genome Dyn,2006,1：84-103.

[9]Hung CJ,Yao CL,Cheng FC,et al.Establishment of immortalized mesenchymal stromal cells with red fluorescence protein expression for in vivo transplantation and tracing in the rat model with traumatic brain injury[J].Cytothreapy,2010,12(4)：455-465.

[10]林若蕓,黎丹戎,鐘艷平,等.過表達人端粒酶逆轉錄酶促進人臍靜脈血管內皮細胞增殖[J].中國生物化學與分子生物學報, 2011,27(1)：84-89.

[11]Brummelkamp TR,Bernards R,Agami R.Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference[J].Cancer Cell,2002,2(3)：243-247.

[12]馬曉生,姜建元,呂飛舟,等.腺病毒和慢病毒載體感染骨髓間質干細胞的比較[J].中華醫(yī)學雜志,2006,86(47)：3340-3344.

[13]張艷,柴崗,劉偉,等.Cathepsin K基因慢病毒質粒載體的構建[J].組織工程與重建外科,2005,1(3)：165-166.

Construction of Recombinant Lentivirus Vector Carrying hTERT Gene and Its Packaging and Expression

MA Di,YAN Jiqi,PENG Chenghong,SHI Minmin,FU Wenwei,WANG Weijie,LI Hongwei.Department of Surgery,Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China;Shanghai Institute of Digestive Surgery,Shanghai 200025,China.Corresponding author:YAN Jiqi(E-mail:yanjiqi@yahoo.com.cn);PENG Chenghong(E-mail:chhpeng@medmail.com).

ObjectiveTo construct the recombinant lentivirus vector containing hTERT gene and detect the expression of hTERT in 293T cells.MethodsThe hTERT gene amplified by PCR was inserted into the lentivirus vector,the recombinant lentivirus vector was transfected into 293T cells with the packaging plasmids and the titre was determined.The expression of hTERT in 293T cells was determined by Western blot.ResultsThe result proved that the recombinant lentivirus vector was constructed successfully and the titre of virus supernatant was 2.79×107Tu/mL.Western blot showed the positive expression of hTERT in 293T cells which were infected by recombinant virus supernatant.ConclusionThe recombinant lentivirus vector could be constructed and packaged successfully,the expression of hTERT gene was positive after the 293T cells were infected by recombinant virus supernatant.

Human telomerase reverse transcriptase;Lentivirus;Recombinant vector

Q786

A

1673－0364（2013）02－0085－04

2013年1月9日；

2013年2月18日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.006

國家自然科學基金（81070358）；上海市自然科學基金（09ZR1418600）。

200025上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院外科；上海消化外科研究所。

嚴佶祺（E-mail：yanjiqi@yahoo.com.cn）；彭承宏（E-mail：chhpeng@medmail.com）。