陳秀萍 楚建軍 王忠超

目前研究認為組蛋白去乙?；?HDAC)在胃癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常黏膜組織，提示HDAC1參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)已廣泛用于癲癇和精神疾病治療中，越來越多的研究表明，丙戊酸鈉作為組蛋白去乙?；敢种苿┚哂锌鼓[瘤的作用，但關于其在腫瘤放療方面的作用報道較少。本實驗應用不同濃度的丙戊酸鈉作用胃癌細胞系SGC-7901，觀察其細胞毒性及放射增敏用，并探討其機制，為丙戊酸鈉應用于胃癌放射治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 人胃癌細胞株SGC-7901細胞由蘇州大學附屬第四人民醫(yī)院腫瘤研究所提供;胎牛血清購自杭州四季青公司，高糖DMEM、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Giemsa染色、凱基細胞周期檢測試劑盒均購自南京凱基生物公司;注射用丙戊酸鈉購自南開允公藥業(yè)有限公司。美國Varian公司23EX醫(yī)用直線加速器，F(xiàn)ACS Vantage SE型流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.1.2 細胞照射方法 應用6MV X線等中心照射，機架旋轉(zhuǎn)180度，源皮距為100 cm，射野大小為10 cm×10 cm，劑量率為200 cGy/min。根據(jù)不同的照射劑量計算相應的Mu值。為使劑量平均分布，及細胞達最大吸收劑量，照射時其上下各置1.5 cm厚的組織等效填充物。

1.1.3 細胞培養(yǎng) 將人胃癌細胞株SGC-7901細胞置于含有10%胎牛血清、鏈霉素和青霉素各100 U/mL的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至70% ～80%融合時，用PBS洗滌，0.25%胰酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測丙戊酸鈉對SGC-7901細胞抑制率 取對數(shù)生長期SGC-7901細胞，消化制成細胞懸液，設空白組(只有培養(yǎng)液，不含有細胞和丙戊酸鈉)和對照組(含有細胞和培養(yǎng)液但不加丙戊酸鈉)，4 000個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，加入用DMEM培養(yǎng)液稀釋的200 μL不同濃度的丙戊酸鈉(0.75、1.5、3.0、4.0、8.0 mmol/L)，每個濃度取3個時間點檢測(24、48、72 h)，設6個復孔，培養(yǎng)24、48、72 h 后加 MTT 50 μL 再培養(yǎng) 4 h。棄上清，加150 μL DMSO，避光平板搖床震蕩10 min，使結(jié)晶顆粒充分溶解，酶標儀檢測各孔490 nm處的吸光度(OD)值。實驗重復3次。計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%，根據(jù)半數(shù)抑制濃度(IC50)，計算丙戊酸鈉作用胃癌細胞株SGC-7901細胞不同時間點后50%的細胞生長抑制的濃度，即IC50。上述實驗重復3次。

1.2.2 細胞周期檢測 實驗分為4組。對照組:加入不含丙戊酸鈉的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h;單純放療組:加入培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h后進行4 Gy照射，繼續(xù)培養(yǎng)44 h;藥物組:加入含3.0 mmol/L的丙戊酸鈉的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h;聯(lián)合組:加入含3.0 mmol/L的丙戊酸鈉的培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h后進行4 Gy照射，繼續(xù)培養(yǎng)44 h。收集細胞1×106/ml，用預冷的70%乙醇固定，染色前洗去固定液，用 PBS洗 3遍，加 100 μL RNase A 37℃水浴 30 min，加入400 μL PI染色混勻，4℃避光30 min，應用流式細胞儀檢測，記錄細胞周期各時相的百分比，每組重復3個樣本，取平均值。

1.2.3 細胞凋亡檢測 實驗分組同1.2.2，收集(1～5) ×105/ml細胞，加入 500 μL 的 Binding Buffer懸液細胞，加入5 μL Annexin V-FITC 混勻，加入5 μL PI混勻。室溫避光反應15 min，1 h內(nèi)應用流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用統(tǒng)計軟件包SPSS 17.0進行方差分析，計量資料以表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度丙戊酸鈉作用不同時間胃癌SGC-7901細胞抑制率

MTT檢測結(jié)果顯示，丙戊酸鈉可顯著抑制SGC-7901細胞生長，呈濃度、劑量依賴性(圖1)，各組間比較P＜0.05。根據(jù)丙戊酸鈉對胃癌SGC-7901細胞的生長抑制率計算其作用24、48、72 h的 IC50分別為19.83、3.67、2.75 mol/L。

圖1 不同濃度丙戊酸鈉對胃癌SGC-7901細胞的抑制

2.2 流式細胞術檢測各組SGC-7901細胞周期的分布

SGC-7901細胞經(jīng)丙戊酸鈉和放療處理后，G0/G1期細胞比例增大，S期細胞比例明顯減小，而這種情況在丙戊酸鈉聯(lián)合放療組中更為明顯，差異均具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(表1)。

表1 FCM檢測SGC-7901細胞周期分布(，%)

表1 FCM檢測SGC-7901細胞周期分布(，%)

*為與對照組比較P＜0.05，△為與藥物組比較 P＜0.05，○為與放療組比較，P ＜0.05

/M對照組組別 G0/G1 S G2 10.8 ±0.59 51.0 ±1.55 35.8 ±0.80 13.2 ±1.45藥物組 63.9 ±1.96* 24.3 ±0.81* 11.8 ±0.50放療組 61.7 ±0.54* 26.1 ±0.90* 12.2 ±1.31聯(lián)合組 71.5±0.86＊△○ 17.7±0.77＊△○

2.3 流式細胞術檢測各組SGC-7901細胞凋亡情況

丙戊酸鈉組、放療組、聯(lián)合組SGC-7901細胞凋亡率均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且聯(lián)合組凋亡率高于丙戊酸鈉組及放療組(P＜0.05)(表2)。

表2 FCM檢測SGC-7901細胞凋亡情況(，%)

表2 FCM檢測SGC-7901細胞凋亡情況(，%)

*為與對照組比較P＜0.05，△為與藥物組比較 P＜0.05，○為與放療組比較P＜0.05

組別 凋亡率(%)2.69 ±0.07藥物組 20.35 ±0.49*放療組 14.89 ±1.13*聯(lián)合組 31.32 ±1.03對照組＊△○

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。每年約有60余萬人因胃癌死亡，居癌癥死因的第2位［1］。隨著放射源的發(fā)展，放射生物學的進步以及治療方法的改進，特別是直線加速器應用于臨床后，已有研究報道，術后輔助的放療或放化療不僅能提高胃癌的局控率，而且還能提高胃癌患者的生存率［2］。Mayo Clinic組的研究結(jié)果提示:增加放療劑量可以明顯提高胃癌患者的術后局部控制率和長期生存率。但胃周圍重要器官如肝、小腸、腎和脊髓等對放射線耐受性［3］，限制了治療劑量的提高。由于胃癌對放療的敏感性有限，因此放射增敏劑可以用于增強放療敏感性［4］。

組蛋白乙酰化/去乙?；捌湔{(diào)節(jié)酶的異常與胃癌發(fā)生、發(fā)展存在密切的聯(lián)系。其中組蛋白乙?；?HAT)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)是組蛋白乙?；年P鍵酶，決定著組蛋白的乙?；潭?，參與腫瘤異常基因表達。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性改變與腫瘤的發(fā)生相關。近期研究發(fā)現(xiàn)，HDAC出現(xiàn)在調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡的蛋白復合體中。HDACs調(diào)節(jié)各種組蛋白和非組蛋白的乙?；?，控制基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與細胞周期、增殖、存活、DNA修復和分化［5］。組蛋白的乙?；腿ヒ阴；g的平衡是調(diào)節(jié)基因表達的1個重要因素，通常認為組蛋白的高乙?；腔钴S轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)的1個標志，而低乙?；瘎t與轉(zhuǎn)錄抑制有關［6］。丙戊酸鈉(VPA)是治療癲癇的1種傳統(tǒng)藥物，毒副作用比較小。近期研究證實其是HDAcs特異性抑制劑之一，能使染色體成阻抑結(jié)構而抑制基因的轉(zhuǎn)錄［7］，在體外對于多種腫瘤細胞系有抑制細胞增殖作用。因此，增強HAT表達和(或)降低HDACs表達就成為腫瘤治療研究的新思路。HDACs抑制劑在治療腫瘤中的作用也日益受到重視。

本實驗觀察選擇性HDAC抑制劑丙戊酸鈉對胃癌SGC-7901細胞增殖抑制、細胞周期和細胞凋亡，探討其放射增敏機制。我們將VPA應用于胃癌細胞系SGC-7901，通過體外實驗證實，VPA可明顯抑制胃癌細胞的生長，并且此抑制作用呈劑量與時間依賴趨勢，G0/G1期細胞群比例增加，S期細胞群比例明顯減少，而這種趨勢在丙戊酸鈉聯(lián)合放療組中更為;在誘導細胞凋亡方面，各試驗組均有不同程度凋亡增強，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，丙戊酸鈉聯(lián)合放療組凋亡趨勢更加明顯。上述結(jié)果表明，丙戊酸鈉、放療均能使細胞周期阻滯在G0/G1期，且聯(lián)合組對G0/G1期的阻滯作用更加顯著。一般來說，不同時相細胞的放射敏感性有區(qū)別［8］，G2/M期對放射線最為敏感，其次是G1期，S期則最不敏感。有實驗研究表明，丙戊酸鈉可以通過上調(diào)P21(Waf/cip1)，Mad1的表達及其下調(diào)Cyclin A，c-Myc的表達使BGC823細胞阻滯于G1期，并通過誘導Caspase 9和Caspase 3的活性來調(diào)節(jié)凋亡［9］。

綜上所述，丙戊酸鈉對胃癌細胞SGC-7901有較好的抑制效果，其機制可能與丙戊酸鈉改變了細胞周期分布、增加了放射敏感性有關。對丙戊酸鈉放療增敏作用及其機制的進一步研究必將為胃癌的治療開辟出新的途徑。

［1］鄭 奇，龍 劍，邱 卓.進展期胃癌的綜合治療現(xiàn)狀及進展〔J〕.實用癌癥雜志，2009，24(3):324.

［2］李夷民，吳君心，潘建基.胃癌術后放射治療的進展〔J〕.實用癌癥雜志，2007，22(5):532.

［3］Jansen Ep，Saunders MP，Boot H，et al.Prospective study on late renal toxicity following postoperative chemoradiotherapy in gastric cancer〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2007，67:781.

［4］Xinhua Liao，Xiangming Che，Wei Zhao，et al.Effects of propranolol in combination with radiation on apoptosis and survival of gastric cancer cells in vitro〔J〕.Radiation Oncology，2010，5:98.

［5］K Ted Thurnl，Scott Thomasl，Amy Moorel，et al.Rational therapeutic combinations with histone deacetylase inhibitors for the treatment of cancer〔J〕.Future Oncol，2011，7(2):263.

［6］Rea S，Eisenhaber F，O＇Carroll D，et al.Regulation ofchromatin st ructure by site2specific histone H3met hylt ransferases〔J〕.Nature，2000，406(6796):593.

［7］Marks PA，Rifkind RA，Richon VM，et al.Histone deacetylases and cancer:causes and therapies〔J〕.Nature，2001，1:194.

［8］Pawlik TM，Keyomarsi K.Role of cell cycle in mediating sensitivity to radiotherapy〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2004，59(4):928.

［9］Zhao X，Yang W，Shi C，et al.The G1phase arrest and apoptosis by intrinsic pathway induced by valproic acid inhibit proliferation of BGC-823 gastric carcinoma cells〔J〕.Tumour Biol，2011，32(2):335.