張 璇 張玉萍 譚曉華

樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)瘤苗是目前最常用的腫瘤主動(dòng)性免疫治療策略之一，應(yīng)用體外培養(yǎng)DC并給予相應(yīng)的抗原刺激，將其作為1種腫瘤治療性疫苗來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)相應(yīng)腫瘤抗原的特異性免疫反應(yīng)，該方法已在大量的體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得證實(shí)，并有許多臨床試驗(yàn)研究的報(bào)道。樹(shù)突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程是將DC前體細(xì)胞如CD14+單核細(xì)胞通過(guò)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和白介素4(interleukin-4，IL-4)誘導(dǎo)分化成為不成熟DC，然后給予抗原刺激并誘導(dǎo)DC成熟后完成DC作為1種特定腫瘤疫苗的制備。其中誘導(dǎo)DC成熟十分重要，只有成熟的DC才能產(chǎn)生主動(dòng)性腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)[1]，而非成熟DC可能會(huì)導(dǎo)致免疫耐受[2]。目前臨床上誘導(dǎo)DC成熟最為常用的方案是，在非成熟DC中加入多種細(xì)胞因子包括IL-1β 、IL-6、TNF-α和PGE2，共孵育24～48 h[3]，這種方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、成本高等不足。此外，常通過(guò)采用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法對(duì)DC進(jìn)行修飾，以期達(dá)到增強(qiáng)DC刺激腫瘤特異性CTL產(chǎn)生的能力，其中最常用的手段之一是用腺病毒載體表達(dá)各類(lèi)基因感染DC[4]。本研究構(gòu)建了共表達(dá)CD40L和IL-2的5/F35嵌合型腺病毒載體，能高效感染人單核細(xì)胞來(lái)源的DC(monocyte-derived dendritic cells，Mo-DC)，并誘導(dǎo)Mo-DC成熟和IL-12的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

各種限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自日本TaKaRa公司，Phusion高保真PCR酶、T4DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司，ThermoScriptTM試劑盒、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM和真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Myc-His(-)B購(gòu)自Invitrogen公司，流式細(xì)胞儀抗體CD80-PE，CD86-PE，DC83-PE、CD40-PE、CD40L-PE和HLA-DR-PE購(gòu)自美國(guó)BD公司，RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit)購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司，質(zhì)粒提取、純化和膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA Bio-Tek公司，AdMaxTMCre重組腺病毒系統(tǒng)購(gòu)自加拿大Microbix Inc公司，IL-2和IL-12 ELISA試劑盒購(gòu)自法國(guó)Diaclone公司，各種培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。

1.2 人CD40L和IL-2的克隆

用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PMBCs)后，用RNA提取試劑盒提取總RNA，按ThermoScriptTM試劑盒說(shuō)明書(shū)合成第一鏈cDNA。分別按人CD40L 和hIL-2在GenBank登記的序列號(hào)NM_000074(CD40L)和NM_000586(IL-2)設(shè)計(jì)二對(duì)引物。CD40L上游引物：5’-ggaattcgccatggtcgaaacatacaacc-3’ (5’端引入EcoRⅠ位點(diǎn)，下劃線(xiàn)部分表示引入位點(diǎn)，下同)；下游引物：5’-cgggatcctcagagtttgagtaagcc-3’(5’端引入BamHⅠ位點(diǎn))。 IL-2上游引物：5’-cgggatccatggacaggatgcaactc-3’(5’端引入BamH Ⅰ位點(diǎn))；下游引物：5’-cccaagcttcaagtcagtgttgagatgatg-3’(5’端引入Hind Ⅲ位點(diǎn))。擴(kuò)增的PCR片段分別插入pcDNA3.1/Myc-His(-)B真核表達(dá)載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，分別構(gòu)建pcDNA3.1(-)CD40L和pcDNA3.1(-) IL-2，測(cè)序證明克隆序列的正確性。

1.3 Ad5/F35 CD40L-IL-2腺病毒載體的構(gòu)建和擴(kuò)增

為構(gòu)建共表達(dá)CD40L和IL-2腺病毒載體，先構(gòu)建共表達(dá)CD40L和IL-2的腺病毒載體穿梭質(zhì)粒pDC315 CD40L-IL-2。用EocR I和BamH I雙酶切將CD40L片段從pcDNA3.1(-)CD40L切下，插入腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315(加拿大Microbix Inc公司)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，構(gòu)成pDC315 CD40L。為構(gòu)建內(nèi)部核酸加入位點(diǎn)(IRES)連接的IL-2，設(shè)計(jì)一對(duì)IL-2引物，上游引物：5 ’-catgccatggacaggatgcaactcc-3 ’(在5’端引入Nco Ⅰ位點(diǎn))，下游引物：5 ’-ccgctcgagtcaagtcagtgttgagat-3’(在5’端引入Xho I位點(diǎn))。PCR從pcDNA3.1(-) IL-2質(zhì)粒中擴(kuò)增IL-2片段并用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，pmRNA IRES-luc[5]載體亦用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，電泳膠回收pmRNA IRES片段，將IL-2和pmRNA IRES連接構(gòu)建pmRNA IRES-IL-2。再用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，膠回收含IRES-IL-2片段，插入pDC515 GM-CSF相應(yīng)位點(diǎn)，形成pDC315 CD40L-IRES-IL-2(簡(jiǎn)寫(xiě)成pDC315 CD40L- IL-2)。

Ad5/F35 CD40L-IL-2腺病毒載體的包裝送北京本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司，在公司包裝成功獲得毒種經(jīng)PCR鑒定正確后，將毒種感染293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，收集293細(xì)胞凍溶裂解后，用2次CsCl梯度離心獲得純化的Ad GM-CSF-IL-2。采用TCID50法鑒定病毒滴度。

1.4 人單核細(xì)胞來(lái)源DC的培養(yǎng)

取健康供者外周血20 ml，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離出人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，采用黏附貼壁法培養(yǎng)DCs，方法參照文獻(xiàn)[6]。PBMCs用RPMI-1640完全性培養(yǎng)基(PRMI-1640培養(yǎng)基加10%的胎牛血清)重懸，按2×106/ml加入一次性175 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，貼壁1 h后吸出非黏附的細(xì)胞和培養(yǎng)液，加入含GM-CSF(800 U/ml)和IL-4(250 U/ml)的RPMI-1640完全性培養(yǎng)液20 ml，培養(yǎng)至第3天后，再補(bǔ)充上述含GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)液20 ml，培養(yǎng)至第5天，行表型鑒定或?qū)⑵涓腥鞠俨《竞筮M(jìn)行下游檢測(cè)。

1.5 腺病毒載體感染DC

收集培養(yǎng)至第5天的DC，離心后用含GM-CSF和IL-4的RPMI-1640完全性培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105/ml，加入6孔板中，每孔3 ml。按100 pfu/細(xì)胞病毒滴度加入Ad5/F35 CD40L-IL-2或Ad5/F35 EGFP[7]，感染2 h后收集細(xì)胞，離心并用含GM-CSF和IL-4的RPMI-1640完全性培養(yǎng)液重懸后放回6孔板中，分別于6、12和24 h后收取少量上清后凍存至-20℃直至行ELISA檢測(cè)及24 h后收集DC進(jìn)行表型測(cè)定，取Ad5/F35 EGFP感染的少許DC，用4%的多聚甲醛固定后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

DC表型測(cè)定、腺病毒載體對(duì)DC感染的效率用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。收集待檢細(xì)胞，離心(1000 rpm，5 min)，用PBS洗1次。再次離心，如檢測(cè)腺病毒感染效率，則用400 μl PBS重懸后上機(jī)檢測(cè)；如行表型測(cè)定，則向細(xì)胞中加入待染的單抗，室溫下避光孵育30 min后用PBS洗2次，再用400 μl PBS重懸后上機(jī)檢測(cè)，流式細(xì)胞儀為Beckman-Coulter四色流式細(xì)胞儀(Coulter Epics XL)。

1.7 ELISA檢測(cè)

將上述各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的培養(yǎng)液解凍，所有樣本稀釋5倍后，按IL-2和IL-12 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法測(cè)定上清中IL-2和IL-12蛋白的水平。

2 結(jié)果

2.1 CD40L和IL-2基因的克隆結(jié)果

從健康人PBMCs獲取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，應(yīng)用CD40L和IL-2克隆引物PCR擴(kuò)增可獲得兩條大小分別約700 bp和450 bp左右的片段，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Myc-His(-)B相應(yīng)的位點(diǎn)中，經(jīng)相應(yīng)引物鑒定，陽(yáng)性克隆送生工(北京)生物科技有限公司測(cè)序證實(shí)，克隆獲得的CD40L和IL-2片段序列分別與GenBank提供的CD40L NM_000074(708 bp)序列號(hào)和IL-2 NM_000586(462 bp)序列號(hào)序列完全一致。

2.2 Ad5/F35 CD40L-IL-2的構(gòu)建結(jié)果

先將CD40L亞克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315中，然后再將IRES-IL-2片段插入GM-CSF后，使CD40L和IL-2通過(guò)IRES序列串聯(lián)起來(lái)，并在同一CMV啟動(dòng)子的調(diào)控下。將構(gòu)建好的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315 CD40L-IL-2送腺病毒包裝專(zhuān)業(yè)公司北京本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司進(jìn)行包裝出毒，提取毒種DNA行PCR鑒定，分別用CD40L和IL-2克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得兩條與CD40L和IL-2基因片段大小一致的片段(圖1)，表明CD40L和IL-2均在腺病毒DNA基因組上。毒種通過(guò)在293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增，并用CsCl純化，即可獲得1010～1011pfu的病毒滴度的病毒。

圖1 引物PCR擴(kuò)增Ad5/F35 CD40L-IL-2病毒DNA結(jié)果

2.3 Mo-DC的表型特征

培養(yǎng)至第5天的DC，分別用CD86、CD80、CD83、CD40和HLA-DR抗體染色。結(jié)果顯示，第5天的DC表現(xiàn)為不成熟的表型，即CD80、CD86、CD40等共刺激分子和MHC Ⅱ分子HLA-DR適度表達(dá)，而CD83呈低表達(dá)(圖2)。

圖2 腺病毒感染Mo-DC前后表型的變化

2.4 Ad5/F35腺病毒載體對(duì)Mo-DC的感染效率

病毒滴度為100 pfu/細(xì)胞的Ad5/F35 EGFP或Ad5/F35 CD40L-IL-2感染Mo-DC 24 h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP的表達(dá)率，結(jié)果顯示Ad5/F35 EGFP對(duì)Mo-DC的感染效率為76.8%，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD40L表達(dá)，其表達(dá)率基本與EGFP相近，為75.2%(圖3)。熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光。

2.5 Ad5/F35 CD40L-IL-2誘導(dǎo)Mo-DC的成熟和產(chǎn)生IL-12

病毒滴度為100 pfu/細(xì)胞的Ad5/F35 EGFP或Ad5/F35 CD40L-IL-2感染Mo-DC 后24 h后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Mo-DC的表型變化，結(jié)果顯示Ad5/F35EGFP感染Mo-DC 24 h后，CD86、CD80、CD83和CD40 和HLA-DR的表達(dá)水平上調(diào)，而感染Ad5/F35 CD40L-IL-2 24 h后，DC表面CD86、CD80、CD83、CD40和HLA-DR的表達(dá)水平上調(diào)更為明顯(圖2)，表明腺病毒本身感染Mo-DC可誘導(dǎo)DC的激活和成熟，而在DC表達(dá)CD40L后其表型改變更為明顯，更傾向于成熟表型。ELISA檢測(cè)Ad5/F35 CD40L-IL-2或Ad5/F35 EGFP感染Mo-DC 6 h、12 h和24 h時(shí)細(xì)胞上清中IL-2和IL-12的含量，結(jié)果顯示見(jiàn)圖4A，當(dāng)CD40L-IL-2感染Mo-DC 6 h后即可檢測(cè)到IL-12的表達(dá)，感染24 h后其表達(dá)量會(huì)繼續(xù)上升，盡管單純的Ad5/F35 EGFP感染也能誘導(dǎo)IL-12的產(chǎn)生，且分泌方式相似，但I(xiàn)L-12的分泌量卻明顯低于Ad5/F35 CD40L-IL-2感染DC后的分泌量，兩者相差2～8倍。此外，檢測(cè)感染了Ad5/F35 CD40L-IL-2的Mo-DC培養(yǎng)上清液，可檢測(cè)到高水平的IL-2，而Ad5/F35 EGFP感染的Mo-DC中其僅呈低水平表達(dá)(圖4B)。

圖3 Ad5/F35腺病毒載體對(duì)Mo-DC的感染效率

圖4 Mo-DC感染腺病毒載體后IL-12和IL-2的表達(dá)

3 討論

以DC為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療是目前常用的腫瘤免疫治療策略之一。DC獲得腫瘤相關(guān)抗原的刺激后，需對(duì)抗原信息進(jìn)行加工、處理并遞呈給T細(xì)胞，使初始(na?ve)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成能識(shí)別和殺傷相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。從DC誘導(dǎo)CTL的產(chǎn)生至少需要3個(gè)信號(hào)[8]，其中腫瘤抗原經(jīng)DC的加工、處理后以MHC-抗原肽復(fù)合物(第一信號(hào))的形式遞呈給T細(xì)胞，包括CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，而DC表面表達(dá)的共刺激分子如CD80、CD86和CD40等作為第二信號(hào)與T細(xì)胞表面表達(dá)的共刺激分子配基相互作用，活化T細(xì)胞以及DC和CD4+T細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子(第三信號(hào))主要包括IL-2、IL-12和TNF-α等Th1細(xì)胞因子促進(jìn)效應(yīng)性CD8+T淋巴細(xì)胞的大量增殖，從而產(chǎn)生具有腫瘤抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。體外培養(yǎng)DC多從外周血CD14+的單核細(xì)胞(Monocytes)通過(guò)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)分化而成，但經(jīng)上述2種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的DC為不成熟表型，即表面共刺激分子和MHC Ⅱ分子的表達(dá)較低，這些不成熟的DC需要誘導(dǎo)成熟后才能作為瘤苗刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中，常用細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)DC的成熟[9]，而在臨床背景下，常用多種細(xì)胞因子組合即IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2共孵育24～48 h[3]。但這類(lèi)方法存在耗時(shí)長(zhǎng)(24～48 h)、成本高等缺點(diǎn)。DC對(duì)淋巴瘤的免疫治療在臨床應(yīng)用中也得到較好療效[10]。已知CD40和CD40L的相互作用對(duì)DC功能十分重要，在體內(nèi)，CD4+T細(xì)胞表達(dá)的CD40L和DC表面的CD40相互作用，是DC刺激產(chǎn)生腫瘤特異性CTL產(chǎn)生的必要條件[11]，應(yīng)用抗CD40單克隆抗體或CD40L刺激DC可使DC不依賴(lài)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)[12,13]。用表達(dá)CD40L的腺病毒載體[14,15]感染DC在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)能有效地誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答，而誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答與CD40L誘導(dǎo)DC的成熟和多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)[16]，特別是IL-12的產(chǎn)生[17]。有學(xué)者把表型為DC成熟表型，但不產(chǎn)生IL-12的DC稱(chēng)之為半成熟DC，只有同時(shí)為成熟表型且產(chǎn)生IL-12的DC稱(chēng)之為成熟的DC，只有成熟的DC才能誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答[18]。

本研究構(gòu)建了一個(gè)共表達(dá)CD40L和IL-2的5/F35嵌合型腺病毒載體，感染人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的DC后可誘導(dǎo)DC表型成熟和產(chǎn)生大量的IL-12。本研究具有以下特點(diǎn)：①共表達(dá)CD40L和IL-2有利于增強(qiáng)抗腫瘤效果：?jiǎn)为?dú)用腺病毒載體表達(dá)CD40L已被證實(shí)能有效地誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答[19]，但DC刺激腫瘤特異性CTL產(chǎn)生后CTL的大量增殖需要多種淋巴細(xì)胞增殖因子的刺激，特別是IL-2，盡管DC和CD4+T淋巴細(xì)胞本身也能產(chǎn)生一定量的IL-2，但外源性表達(dá)IL-2作用更穩(wěn)定和更持久。研究證實(shí)，CD40L和IL-2具有協(xié)同的抗腫瘤效果，而Rousseau等則將這些體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果轉(zhuǎn)化至臨床，他們應(yīng)用Ad IL-2和Ad CD40L感染原代培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞后與自體白血病細(xì)胞混合后皮內(nèi)注射，可在患者體內(nèi)監(jiān)測(cè)到機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)白血病細(xì)胞的應(yīng)答[20]。我們將CD40L和IL-2共表達(dá)在同一載體上，在今后可能的應(yīng)用中，可減少操作步驟(只需生產(chǎn)一個(gè)載體)和降低成本等；此外，應(yīng)用表達(dá)CD40L腺病毒載體感染DC后可明顯縮短DC在體外成熟的時(shí)間，因?yàn)橐坏〥C感染腺病毒后，CD40L誘導(dǎo)DC成熟的過(guò)程是恒定的，不會(huì)因?yàn)镈C是在體內(nèi)還是在體外發(fā)生改變。因此，DC被腺病毒感染后即可進(jìn)行接種，讓DC的成熟過(guò)程在體內(nèi)完成，而無(wú)需像用細(xì)胞因子誘導(dǎo)成熟那樣需在體外培養(yǎng)24～48 h。②利用5/F35嵌合型腺病毒作為載體，可高效地感染造血系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞包括樹(shù)突狀細(xì)胞。已知5型腺病毒對(duì)包括樹(shù)突狀細(xì)胞在內(nèi)的造血系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞感染效率低下，因?yàn)樵煅到y(tǒng)來(lái)源細(xì)胞的柯薩奇-腺病毒受體(CAR)表達(dá)較低甚至缺失[21]，5型腺病毒進(jìn)入細(xì)胞需要依賴(lài)該受體；而5/F35嵌合型腺病毒載體進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制是通過(guò)CD46，該分子普遍表達(dá)在各類(lèi)細(xì)胞包括造血系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞[22]。5/F35嵌合型腺病毒載體能高效感染人單核細(xì)胞來(lái)源的DC[23]，我們的研究也獲得了相似的結(jié)果。③一個(gè)腺病毒載體同時(shí)編碼2個(gè)基因，用內(nèi)部核酸進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列將CD40L和IL-2 2個(gè)基因連接，受一個(gè)CMV啟動(dòng)子調(diào)控，2個(gè)基因均獲得有效表達(dá)。盡管IRES是1種常用的雙基因表達(dá)載體的構(gòu)成元件[24,25]，但在不同的體系下，IRES連接的2個(gè)基因的表達(dá)水平并不完全一致，常常是靠近啟動(dòng)子的基因表達(dá)水平高，而IRES下游的基因表達(dá)水平較低，甚至不能有效地表達(dá)[26]。而本研究中證實(shí)用IRES連接的CD40L和IL-2均能獲得高效的表達(dá)，可能與利用Nco I位點(diǎn)(ccatgg)將連接IRES和IL-2，形成Kozak序列(accatgg)，有利于IL-2的表達(dá)。

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