賈永宏，馬國(guó)際，王春偉，洪潔赟，胡建宏*

(1．陜西省家畜改良站，陜西 涇陽(yáng) 713702；2．西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

從20世紀(jì)科學(xué)家開(kāi)始研究家畜精液冷凍技術(shù)開(kāi)始，經(jīng)過(guò)多年不斷的深入探索，目前牛的冷凍精液已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，廣泛用于人工授精技術(shù)。目前牛的冷凍精液在家畜中最為成功，但冷凍-解凍過(guò)程發(fā)生的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)降低了精子質(zhì)量，并導(dǎo)致40%～50%的精子失去活力。在稀釋液中添加抗氧化劑可以清除精液冷凍-解凍過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)多活性氧(reactive oxygen species, ROS)，提高精子抗氧化損傷的能力，進(jìn)一步提升家畜冷凍精液的質(zhì)量。本文就目前一些主要的維生素、抗氧化酶等抗氧化劑在家畜精液冷凍保存中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步提高家畜冷凍精液的品質(zhì)提供一定的基礎(chǔ)，切實(shí)提高家畜冷凍精液的質(zhì)量。

1 精液冷凍-解凍過(guò)程氧化損傷機(jī)理

在冷凍-解凍過(guò)程中，很多物理和化學(xué)反應(yīng)發(fā)生在精子膜上，降低了精子活力和受精能力。Aitken等[1]研究認(rèn)為，ROS通過(guò)引發(fā)精子膜上的多聚不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，由于產(chǎn)生大量脂類過(guò)氧化物，導(dǎo)致精子膜不可逆地被破壞或消失，直接抑制精子的運(yùn)動(dòng)性能。精子存活率的高低反映精子生存能力和精子質(zhì)量的優(yōu)劣，而精子運(yùn)動(dòng)能力是正常成熟精子的重要功能，是精子受精能力高低的重要指標(biāo)之一。Chatterjee等[2]研究認(rèn)為，在冷凍精液的制作過(guò)程中，由于外界各種因素的相互作用，增加了死亡精子和受損精子的數(shù)量，導(dǎo)致產(chǎn)生ROS。精子的冷應(yīng)激和冷凍損傷都是由ROS和氧應(yīng)激的產(chǎn)生所引起，過(guò)氧化損傷是冷凍-解凍后精子質(zhì)量下降的重要原因。在正常生理?xiàng)l件下，精子的ROS處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在精液的冷凍-解凍過(guò)程中因精子與外界環(huán)境相接觸，致使這種平衡狀態(tài)被打破，精子ROS增加，引起精子膜的流動(dòng)性改變，線粒體和DNA損傷，降低了精液品質(zhì)[2]。

2 抗氧化劑對(duì)冷凍精液品質(zhì)的影響

2.1 維生素類抗氧化劑

2.1.1 維生素E 維生素E又名α-生育酚，是動(dòng)物身體重要的抗氧化劑，對(duì)組織線粒體、網(wǎng)狀組織或漿膜的磷脂有著特殊的親和性，并且存在于細(xì)胞膜的特定部位。Ball等[3]研究認(rèn)為，在馬的精液稀釋液中添加維生素E后明顯提高了精子活力和頂體完整率，說(shuō)明維生素E對(duì)精子具有冷凍損傷具有保護(hù)作用。羅海玲等[4]研究認(rèn)為，綿羊冷凍精液的稀釋液中補(bǔ)充維生素E后，因?yàn)樽杂苫男纬墒艿揭种?，有效預(yù)防或阻止脂質(zhì)過(guò)氧化的誘發(fā)，保護(hù)精子細(xì)胞膜免受氧化損傷，同時(shí)保護(hù)了精子膜酶的活性。Pena等[5]研究證明，在豬冷凍精液稀釋液中加入維生素E可以改善凍后精子質(zhì)量，但其添加量不應(yīng)超過(guò)200 μg/ mL，否則對(duì)精子產(chǎn)生一定的毒害作用。在牛的冷凍精液稀釋液中添加維生素E后，不僅能夠有效提高精子的運(yùn)動(dòng)性能和頂體完整率，而且能夠顯著提高過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD) 、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶( GSH) 、谷胱甘肽還原酶( GR) 的活性[6]。Hu等[7]研究表明，稀釋液中添加維生素E能夠增強(qiáng)牛精子抗氧化酶的活性，從而提高精子冷凍-解凍后的質(zhì)量，其適宜劑量為1.5 mg/ml。Sicherle等[8]研究認(rèn)為，稀釋劑中補(bǔ)充維生素E的相似物(Trolox)也能夠顯著降低由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化，但精子功能損傷的具體機(jī)制不甚清楚，有待于進(jìn)一步深入探索。

2.1.2 維生素C 維生素C又稱為抗壞血酸維生素C，是一種抗氧化物質(zhì)，能夠有效防止精液冷凍過(guò)程中精子磷脂發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，提高凍后精子質(zhì)量。Foote等[9]研究證實(shí)，稀釋液中添加維生素C可以明顯減少丙二醛(MDA)的含量，提高冷凍-解凍后牛精子的活力。在低溫保存條件下，由于精子暴露在有氧環(huán)境中，發(fā)生氧化反應(yīng)而產(chǎn)生自由基，致使細(xì)胞高度突變和異化，減弱精子的受精能力。Mustafa等[10]研究發(fā)現(xiàn)，羊精液稀釋液中添加的維生素C含量不高于2 mg/ml時(shí)，對(duì)精子運(yùn)動(dòng)性能和形態(tài)無(wú)明顯影響，但如果添加量達(dá)到5～10 mg/mL時(shí)，則可明顯抑制精子的代謝，延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間，這可能與維生素C偏酸有關(guān)。Cheede等[11]研究表明，稀釋液中補(bǔ)充維生素C明顯改善了精液質(zhì)量，提高了人工授精后水牛的受胎率。趙憲林等[12]用含有維生素C的冷凍稀釋液冷凍奶牛X精子，發(fā)現(xiàn)在短時(shí)間解凍后精子活率變化不顯著，但隨著解凍時(shí)間的延長(zhǎng)，維生素C具有減緩精子死亡的作用，且證明其添加量為4～6 mg/mL時(shí)可有效提高荷斯坦公牛X精子解凍后的活率、質(zhì)膜完整率及頂體完整率。

2.1.3 維生素B12維生素B12是一種含鈷的三價(jià)化合物，又名鈷維生素，是一種生理活性物質(zhì)，能夠改善精子的外在環(huán)境，提高精子的活力。維生素B12的輔酶能使氧化型(-S-S-)輔酶A還原成還原型(-SH-)輔酶A，滿足酶反應(yīng)的需要，同時(shí)也可使氧化型谷胱甘肽和高胱氨酸還原成還原型，而還原型谷胱甘肽對(duì)精子代謝發(fā)揮重要活性。李玉凡等[13]發(fā)現(xiàn)維生素B12注射液解凍奶牛顆粒凍精可提高精子頂體完整率，降低精子畸形率。孫淑琴等[14]研究表明，在稀釋液中采用一定濃度的維生素B12注射液作為保護(hù)精子的添加劑是可行的，但當(dāng)其濃度達(dá)1%時(shí)，精子活力降低，其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

2.2 酶類抗氧化劑

動(dòng)物精子抗氧化系統(tǒng)中的主要成分有超氧化物歧化酶( SOD)、谷胱甘肽還原酶( GSH)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)、輔酶Q10以及精子本身所具有的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)依賴性谷胱甘肽過(guò)氧化酶與還原酶(GR)系統(tǒng)等[15-16]，可以清除O2-、H2O2等，防止過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)生。精子的抗氧化體系中SOD、CAT、GSH和GSH-Px對(duì)維持家畜精子的活力和運(yùn)動(dòng)能力發(fā)揮重要作用。但是，精液冷凍-解凍后其抗氧化酶的活性下降，不能滿足消除過(guò)多ROS的需要，因而可在精液冷凍時(shí)適當(dāng)添加一定量的抗氧化酶類，減少精子的氧化損傷[17-18]。Kasimanickam等[19]研究證明，GSH-Px、SOD對(duì)保護(hù)羊精液免受ROS的毒害具有非常重要的作用。Sariozkan等[20]比較了GSH-Px、GSH和牛血清白蛋白(BSA)對(duì)牛精子活力、頂體異常率、質(zhì)膜完整性、抗氧化酶活性以及精子受精能力的影響，表明稀釋液中添加BSA時(shí)母牛妊娠率最高。張文舉等[21]在牛精液稀釋中添加GSH后發(fā)現(xiàn)精子活力和母牛受胎率明顯提高。易康樂(lè)等[22]研究發(fā)現(xiàn)，冷凍保存液中加入300 IU/mL的SOD 或1.0 mM GSH，可以顯著提高水牛精子凍后活率、存活時(shí)間以及囊胚孵化率。Tuncer等[23]研究了半胱氨酸和谷胱甘肽對(duì)牛精子氧化應(yīng)激的影響，發(fā)現(xiàn)對(duì)精子形態(tài)影響不顯著，但精子DNA的損害程度降低。

2.3 其他抗氧化劑

海藻糖是一種非還原性糖，性質(zhì)穩(wěn)定，可以減緩細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的變化，從而保護(hù)細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)不被破壞。Chen[24]等研究證明，海藻糖能提高冷凍保存的牛精子活力，延長(zhǎng)精子存活時(shí)間。昝林森等[25]研究表明，單獨(dú)添加海藻糖、牛血清白蛋白(BSA)及其相互配伍對(duì)牛精液的冷凍效果顯著優(yōu)于對(duì)照組。稀釋液中單獨(dú)添加不同水平的海藻糖或BSA 對(duì)凍后牛精子活率和質(zhì)膜完整率均有明顯影響，但對(duì)頂體完整率影響不大。Hu等[26]的研究表明，稀釋液中添加海藻糖可以降低由冷凍-解凍引起的氧化應(yīng)激，提高冷凍-解凍后牛精液品質(zhì)。

褪黑激素具有高親脂性和部分親水性，能夠抑制過(guò)氧化氫引起的過(guò)氧化脂質(zhì)含量的升高，有效清除在化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的羥自由基，對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用[27]。李博玲等[28]分別在稀釋液中單獨(dú)添加褪黑素、谷胱甘肽或兩者聯(lián)合添加，發(fā)現(xiàn)均能減少豬精液冷凍過(guò)程中ROS的生成，顯著提高凍后精子質(zhì)量，并且聯(lián)合添加效果顯著優(yōu)于單獨(dú)添加效果。張渭斌等[29]試驗(yàn)表明，稀釋液中補(bǔ)充0.2、0.4 mg/mL的咖啡因時(shí)，豬精子冷凍后活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率顯著高于其他組。Jiang等[30]的研究認(rèn)為，稀釋液中添加低密度脂蛋白能夠有效提高豬精液品質(zhì)。張婷等[31]、潘巧蓮等[32]分別將海帶多糖和紅景天多糖添加到豬精液的冷凍稀釋液中，結(jié)果表明這兩種多糖均可以有效提高精子在冷凍過(guò)程中抵抗氧化損傷的能力，改善精液質(zhì)量。

3 抗氧化劑研究存在問(wèn)題與發(fā)展

精液冷凍保存作為一種先進(jìn)的繁殖技術(shù)，在提高優(yōu)良種公畜的配種效率、加快品種改良進(jìn)程、疾病防治及提高經(jīng)濟(jì)效益等方面發(fā)揮著重要作用。多年來(lái)，科學(xué)家一直嘗試在家畜冷凍精液稀釋液或者解凍液中添加各種抗氧化劑，以便清除冷凍-解凍過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)多活性氧，以便能夠切實(shí)提高家畜冷凍精液的質(zhì)量。但是，眾多研究發(fā)現(xiàn)，家畜冷凍精子超微結(jié)構(gòu)的變化基本發(fā)生在解凍期，而冷凍狀態(tài)下精子的質(zhì)膜、頂體以及線粒體結(jié)構(gòu)基本正常。因此，進(jìn)一步探索在家畜冷凍精液稀釋液中添加適宜的抗氧化劑，探討其作用機(jī)理，對(duì)進(jìn)一步提高冷凍精液的質(zhì)量具有非常重要的意義[33]。

雖然抗氧化劑在家畜精液冷凍保存中的應(yīng)用對(duì)于提高精子質(zhì)量作用顯著，但目前不同報(bào)道的抗氧化劑尤其是維生素類抗氧化劑在家畜精液冷凍保存中應(yīng)用結(jié)果不盡一致，還需要進(jìn)一步深入探究和分析。另外，大多研究主要集中于單獨(dú)加入抗氧化劑的研究方面，很少涉及不同抗氧化劑聯(lián)合在家畜精液冷凍保存中的應(yīng)用，同時(shí)關(guān)于各抗氧化劑是否有協(xié)同作用研究也較少，特別是維生素類和酶類抗氧化劑的聯(lián)合應(yīng)用，應(yīng)該加大不同抗氧化劑聯(lián)合應(yīng)用，以便更好的改善冷凍解凍后精子質(zhì)量。因此，在家畜精液冷凍保存技術(shù)的優(yōu)化方案尤其是稀釋液配方的配伍上，應(yīng)深入開(kāi)展具有良好抗氧化作用的抗氧化劑方面的研究，這是今后家畜精液冷凍保存研究中值得重視的主要環(huán)節(jié)之一。

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