國家食品藥品監(jiān)督管理總局杭州醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，國家重點實驗室（杭州 310009）

一次性使用真空采血管又叫一次性使用人體靜脈血樣采集容器，簡稱采血管，是用于體外診斷檢查，制造商預(yù)期一次使用，含有一定真空度的商品。由蓋帽、塞子、試管、添加劑或附加物等組成。根據(jù)臨床需求不同，產(chǎn)品添加劑可以有很多種不同類型，比如添加劑EDTA 類，為血常規(guī)管，用于血液學(xué)血常規(guī)、全血檢測；添加劑為肝素類，用于快速血漿生化、血流變檢測；添加劑為檸檬酸鈉類，有血凝管用于凝血機制（PT、APTT、凝血因子）檢測，有血沉管用于血細胞沉降率檢測；有促凝管用于生化、免疫、血清等檢驗血液樣本的采集和貯存等等。這些產(chǎn)品具有一定的促凝或者抗凝作用，但是產(chǎn)品的性能怎樣完全取決于產(chǎn)品的預(yù)置真空度和添加劑的多少。當(dāng)產(chǎn)品的真空度確定時，完全取決于產(chǎn)品中添加劑的多少。本文以添加劑為檸檬酸鈉溶液的血凝管和血沉管為例，介紹檸檬酸鈉溶液濃度的檢測方法。

檸檬酸鈉溶液作為采血管的抗凝劑之一，對產(chǎn)品性能起著至關(guān)重要的作用，因而有必要控制真空采血管中檸檬酸鈉溶液的濃度。在YY0314-2007《一次性使用人體靜脈血樣采集容器》附錄NC 中，檸檬酸鈉用于凝血化驗的抗凝劑濃度應(yīng)為（105～109）mmol/l（即3.13%～3.2%，通常被稱為3.2%）的二水合物形式的檸檬酸鈉[1]，用于血細胞沉降率檢測的抗凝劑濃度應(yīng)為（123～135）mmol/l（3.61%～3.96%,通常被稱為3.8%）的二水合物形式的檸檬酸鈉。本文分別通過滲透壓法、高效液相色譜法、非水滴定法、原子分光光度法對檸檬酸鈉溶液濃度進行測定，通過比較，確定了簡單可行的檢測方法。

1.儀器與材料

1.1 儀器

滲透壓摩爾濃度測試儀（天津天河醫(yī)療儀器有限公司SMC-30C），高效液相色譜儀（美國Waters 公司），原子分光光度計（美國PE 公司AA800），超純水機（默克密理博Milli-Q）。

1.2 材料

選用實驗室檢品為本次試驗樣品，檸檬酸鈉二水合物（分析純），乙二酸（分析純），磷酸（色譜純），甲醇（分析純），超純水（實驗室自制），高氯酸（0.1mol/l 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液），冰乙酸（分析純），乙酸酐（分析純），結(jié)晶紫（分析純），鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（500mg/l,國家環(huán)境保護總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所，中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GSB07-1262-2000，鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液證書101405）。

2.方法

2.1 滲透壓法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取檸檬酸鈉10g，置100ml 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度約為100mg/ml 的溶液，再精密量取上述溶液適量，制成含檸檬酸鈉為10-100mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照《中華人民共和國藥典》2010 版附錄ⅨG 滲透壓摩爾濃度測定法，分別測定每點的滲透壓。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出回歸方程。

2.1.2 樣品溶液的制備

取采血管樣品，分別測定每管的滲透壓，將樣品測定值代入回歸方程并計算樣品中檸檬酸鈉溶液的濃度。

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 測試條件

色譜柱：KC-811；流動相：0.5%磷酸溶液；流量：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測器：UV；進樣量：10μl。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液制備

將檸檬酸鈉在105℃條件下干燥3h 后，精確稱取2.5g 于50ml 容量瓶中，溶解，稀釋，搖勻，定容，即得到標(biāo)準(zhǔn)貯備液50mg/ml。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)原液制備

精確移取2.2.2.1 項下標(biāo)準(zhǔn)貯備液5ml、12.5ml 分別置于25ml 的容量瓶中，用水稀釋，搖勻，定容，即得到標(biāo)準(zhǔn)原液10mg/ml、25mg/ml。

2.2.2.3 內(nèi)標(biāo)液制備

精確稱取0.5g 乙二酸到500ml 的容量瓶中，用水稀釋，溶解、搖勻，定容即得。

2.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)液制備

分別精確移取10mg/ml、25mg/ml、50mg/ml標(biāo)準(zhǔn)原液2ml 到100ml 容量瓶中，再加入3ml 的乙二酸內(nèi)標(biāo)液，用水稀釋，搖勻，定容，得到0.2mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用高效液相色譜儀對2.2.2.4 項的標(biāo)準(zhǔn)液進行測試，以濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

2.2.3 供試液的配制與測試

取采血管，第一次稱重得W1（g），用約20ml 的水充分轉(zhuǎn)移采血管內(nèi)檸檬酸鈉溶液至50ml 的容量瓶中，再加入3ml 乙二酸內(nèi)標(biāo)液后，用水稀釋，搖勻，定容得供試液。用高效液相色譜儀測定供試液，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到供試液濃度C（mg/ml）,吹干采血管內(nèi)壁第二次稱重得W2（g），樣品中檸檬酸鈉溶液的密度以1.0g/ml計算。

2.2.4 計算公式

CX=50×1.0×C/294.1×(W1-W2)

CX—樣品中檸檬酸鈉溶液的濃度，mol/l；

C—表示檸檬酸鈉溶液的測試濃度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，mg/ml；

（W1-W2）—表示采血管內(nèi)檸檬酸鈉溶液的重量，g

2.3 非水滴定法

2.3.1 樣品前處理

取20 支采血管，分別用實驗用水將樣品內(nèi)的檸檬酸鈉溶液充分轉(zhuǎn)移至100ml 的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干。

2.3.2 測定方法

取上述蒸干后的檸檬酸鈉固體粉末,用適量約10ml 冰乙酸加熱充分溶解并轉(zhuǎn)移到碘量瓶中,放冷，加乙酸酐10ml,再加 0.5%結(jié)晶紫溶液2 滴,用0.1N 的高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液顯藍綠色,同時做空白滴定試驗 進行校正。

2.3.3 計算公式

C X=N(V-V 0)×0.0 9 8 0 3×1 0 0 0/294.1×20×V1

CX—檸檬酸鈉溶液濃度，mol/l；

N—高氯酸標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)量濃度；

V—試樣滴定消耗用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,ml；

V0—空白滴定消耗用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,ml；

V1—采血管中檸檬酸鈉溶液的體積，ml；

0.09803 —1 毫克當(dāng)量檸檬酸鈉的質(zhì)量，g。

2.4 原子分光光度法

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

依據(jù)樣品中鈉的濃度以及鈉元素的檢測范圍，選擇以下濃度梯度進行稀釋，20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml。

2.4.2 樣品溶液的制備

取2 只采血管樣品，分別用超純水轉(zhuǎn)移至50ml 容量瓶中，反復(fù)清洗，合并所有清洗液，加水稀釋至刻度，搖勻，分別用0.45μm 的微孔濾膜進行過濾，即得二份供試品溶液。按照同樣方法制備空白對照液。

2.4.3 試驗方法

分別將鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的不同濃度進樣，得到不同的吸收率，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸收率為縱坐標(biāo)，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)，同樣的方法將樣品溶液分別進樣，從曲線上可以讀取樣品的濃度，根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出檸檬酸鈉溶液的濃度。

2.4.4 計算公式

X=C×50×0.001/23×V×3

X—樣品中檸檬酸溶液的濃度,mol/l；

C—曲線上鈉元素的濃度，μg/ml；

V—樣品中檸檬酸鈉溶液的體積，ml。

3.結(jié)果

3.1 滲透壓法（表1）

表1.滲透壓法

3.2 高效液相色譜法（表2）

表2.高效液相色譜法

3.3 非水滴定法（表3）

表3.非水滴定法

3.4 原子分光光度法（表4）

表4.原子分光光度法

4.試驗討論

從以上試驗可以看出，每種方法都可以作為檢測一次性使用真空采血管中檸檬酸鈉溶液濃度的方法，但是每種方法又有著不同的優(yōu)缺點。滲透壓法檢測檸檬酸鈉溶液濃度，相關(guān)系數(shù)為0.9998，過程簡單，使用的儀器為滲透壓儀，價格便宜，可操作性強，為方便接受的一種方法；高效液相色譜法檢測檸檬酸鈉溶液濃度，雖然相關(guān)系數(shù)為0.9999，但是試驗過程較復(fù)雜，使用的儀器為高效液相色譜儀，價格昂貴，試驗的可接受程度不強，只能是有條件的單位方可采用的方法；非水滴法測定檸檬酸鈉溶液的濃度，試驗結(jié)果平行樣結(jié)果良好，重現(xiàn)性也好，但是由于該過程試劑的配制比較繁瑣，同時用到試劑乙酸酐，為有毒試劑，在市場上不容易買到，需要專一的領(lǐng)導(dǎo)和技術(shù)人員通過專一的培訓(xùn)后，取得資質(zhì)后方可獲得，給試驗的進行帶來了一定的難度，故該方法也受到一定的限制；原子分光光度法測定檸檬酸鈉溶液的濃度，相關(guān)系數(shù)為0.9997，試驗數(shù)據(jù)可信度較強，操作簡單，但是同樣用到的儀器為原子分光光度計，價格也是比較昂貴，該方法操作起來受到資金的限制，并不是每一個生產(chǎn)企業(yè)都可以達到的，所以也不是最為理想的方法。綜上，滲透壓法檢測檸檬酸鈉溶液濃度為一理想的、可操作性強的、可普及的可靠方法。