梁漢彰

結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)和分型

梁漢彰

目的 探討結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)和分型。方法 采用瓊脂糖凝膠的電泳和PCR技術(shù), 選取200株結(jié)核分枝桿菌六個(gè)能夠變化的重復(fù)點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè), 使用Version3.0及Gel-Proanalyzer3.0軟件對(duì)檢測(cè)的結(jié)果做一個(gè)基因型的分析, 同時(shí)分析結(jié)核分枝桿菌分型與基因間的關(guān)系。結(jié)果 這200株臨床分離的株全部被鑒定是結(jié)核的分枝桿菌；VNTR顯示結(jié)核桿菌株在不同的位點(diǎn)中具有多種形式的DNA指紋圖譜。結(jié)論 應(yīng)用分子檢測(cè)法, 相比常規(guī)性方法, 它具有全信息化、可以重復(fù)以及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

結(jié)核患者；Version3.0軟件；基因分析；檢驗(yàn)；分型

目前, 絕大多數(shù)肺結(jié)核患者就診于各級(jí)綜合性的醫(yī)院,怎樣才能夠有效地提高這些醫(yī)院對(duì)診治肺結(jié)核發(fā)現(xiàn)水平, 這已經(jīng)成為我國(guó)醫(yī)院所面臨的一個(gè)非常迫切的事項(xiàng), 只有提高了醫(yī)院的肺結(jié)核的發(fā)現(xiàn)率,才能夠有效地達(dá)到該病早期的治療, 早康復(fù), 減少該病的傳染［1,2］。對(duì)此, 本文立足結(jié)核分枝桿菌的檢驗(yàn)和分型理論, 結(jié)核相關(guān)前沿性信息, 來(lái)探討結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)和分型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院結(jié)核病防治部門從2010年11月-2012年11月間所接診結(jié)核患者的200株結(jié)核分枝桿菌,透過(guò)臨床上對(duì)分離株實(shí)施有效的分析。

1.2 方法 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的試劑。在對(duì)結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)和分型時(shí)要應(yīng)用GoldViewTMDNA染料、TaqDNA聚合酶以及dNTP, 準(zhǔn)備PCR材料［3］。

實(shí)驗(yàn)室所應(yīng)用的儀器。這些實(shí)驗(yàn)儀器包括DNA的自動(dòng)擴(kuò)增儀、菌體培養(yǎng)箱、生物型的安全柜、恒壓恒流的電泳儀以及凝膠成像的系統(tǒng)［4］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 在本文中, 筆者所采用的相關(guān)數(shù)據(jù)均用(x-±s) 表示, 同時(shí)使用SPSS10.0軟件實(shí)施統(tǒng)計(jì)學(xué)處理, 同時(shí)為加強(qiáng)可信度, 本文中每組之間的數(shù)據(jù)的比較也使用t來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn), 文中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都為平均值。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義。

2 結(jié)果

2.1 在對(duì)這200株結(jié)核分枝桿菌實(shí)施監(jiān)測(cè)的結(jié)果。運(yùn)用TCH與PNB對(duì)這些200株進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 同時(shí)通過(guò)在菌體培養(yǎng)基中出現(xiàn)的問(wèn)題對(duì)這些非結(jié)核性的分枝桿菌、結(jié)核的分枝桿菌進(jìn)行詳細(xì)的分析, 獲得最終結(jié)果為：這200株臨床分離株全部被鑒定為結(jié)核的分枝桿菌。

2.2 在對(duì)這200株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行VNTR的結(jié)果。在本院權(quán)威專家實(shí)施研究后, 作者進(jìn)一步選擇了10個(gè)基因點(diǎn)進(jìn)行研究, 對(duì)這些結(jié)核桿菌實(shí)施相關(guān)性的檢測(cè), 同時(shí)用H37RV作了進(jìn)一步的數(shù)據(jù)對(duì)照。在此實(shí)驗(yàn)中可知在同一位點(diǎn)的擴(kuò)增片段中的大小是不一樣的的, 結(jié)核桿菌株在不同的位點(diǎn)中具有多種形式的DNA指紋圖譜。

2.3 藥敏性的結(jié)果。在藥敏性的檢測(cè)中, 發(fā)現(xiàn)如下結(jié)果：完全敏感的結(jié)核分枝桿菌有160株, 占到總數(shù)的80%；產(chǎn)生耐藥性的結(jié)核分枝桿菌有40株, 占到總數(shù)的20%。

3 討論

隨著居民的物質(zhì)生活水平得到顯著提高, 各種疾病也開(kāi)始侵蝕國(guó)民的身體, 結(jié)核病已成為一種常見(jiàn)傳染性疾病, 它是一種慢性的呼吸道的傳染病, 也是當(dāng)前一個(gè)非常突出的一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題, 現(xiàn)今在我國(guó), 有結(jié)核菌感染者有4億人左右, 活動(dòng)性肺結(jié)核病人有600萬(wàn)左右, 結(jié)核已經(jīng)成為當(dāng)前社會(huì)一種嚴(yán)重威脅人類身體健康的傳染病。

如今, 生物工程發(fā)展迅速, 帶動(dòng)了相關(guān)醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步,臨床上我們運(yùn)用可變數(shù)目的串聯(lián)重新分型技術(shù)可以有效的對(duì)結(jié)核患者的結(jié)核分支桿菌進(jìn)行檢驗(yàn)和分型, 相比常規(guī)性方法,它具有全信息化、可以重復(fù)以及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。由于可以運(yùn)用計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析, 可以大量的輸入樣本數(shù)據(jù)信息, 這樣得到的數(shù)據(jù)比較可靠。

臨床上, 除了應(yīng)用分子技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)外, 還有涂片法、分離培養(yǎng)法、快速結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)等。

涂片法。涂片法一般讓涂抹的面積保持均勻的涂膜厚度,應(yīng)用萋尼的染色抗酸進(jìn)行染色,同時(shí)要求每一個(gè)涂片最小檢測(cè)200個(gè)油鏡視野。金胺石炭酸的染色法中的熒光染色最少要有檢測(cè)的20個(gè)視野, 這種檢測(cè)方法相比前一種方法的陽(yáng)性的檢出率高, 但在特異性上沒(méi)有抗酸染色法優(yōu)。

分離培養(yǎng)法。結(jié)核桿菌在培養(yǎng)基的培養(yǎng)方式常用的有幾種：一是利用雞蛋作為原料的培養(yǎng)基, 一般是運(yùn)用羅氏的培養(yǎng)基。二是運(yùn)用瓊脂作為原料的培養(yǎng)基。三是選擇性的培養(yǎng)基, 它可以與一些非選擇性的培養(yǎng)基一起應(yīng)用, 選擇性的培養(yǎng)基的L-JGrugt 含有奈丁酸、青霉素, 同時(shí)培養(yǎng)基中包括林可霉素、放線酮及綦啶酸。四是液體培養(yǎng)基。

快速結(jié)核的分枝桿菌藥敏性試驗(yàn)。操作方法一般在選用的結(jié)核桿菌的培養(yǎng)基中加進(jìn)一些利福平藥物、熒光指示劑以及異煙肼藥物。培養(yǎng)基中的熒光一般在有氧的情形下會(huì)淬滅,一旦細(xì)菌存活下來(lái)實(shí)施代謝活動(dòng), 就會(huì)消耗培養(yǎng)基中的氧氣,熒光又會(huì)復(fù)發(fā)。應(yīng)用365的紫外線燈下有沒(méi)有熒光來(lái)判斷耐藥或者敏感。這是由于熒蟲(chóng)酶的基因進(jìn)入培養(yǎng)基中的結(jié)核桿菌的嗜菌體, 嗜菌體在侵染存活的結(jié)核桿菌就會(huì)發(fā)出熒光。這些菌體在于一定濃度的藥物相互作用后, 如果這些菌體存活下來(lái)就會(huì)侵染嗜菌體, 觀測(cè)到有熒光的就是耐藥, 沒(méi)有熒光的就是敏感菌。

在一般分型中, 用RFLP技術(shù)實(shí)施結(jié)核菌的分型。臨床上,運(yùn)用結(jié)核的分支桿菌插進(jìn)序列IS6100的片段作為探針, 這樣就能夠運(yùn)用結(jié)核桿菌DNA實(shí)施鑒定、分型, IS6100的片段一般僅存在結(jié)核分支桿菌中的復(fù)合基因組, 利用PVU-Ⅱ進(jìn)行切割, 并用245BP的探針實(shí)施雜交, 這樣就能夠出現(xiàn)9～24條帶,能夠用在流行病學(xué)的分析, 例如在菌株, 結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株是H37RV和減毒性的結(jié)核分枝桿菌是H37RA。測(cè)定菌株經(jīng)改良鑼氏培養(yǎng)基培養(yǎng), 并鑒定為結(jié)核分枝桿菌。

對(duì)于結(jié)核病的管理工作也是一項(xiàng)非常重大環(huán)節(jié), 在以上的預(yù)防措施的基礎(chǔ)上, 建立有效完善的可疑的肺結(jié)核者相關(guān)處理指引和報(bào)告制度。醫(yī)護(hù)人員一旦發(fā)現(xiàn)可疑的肺結(jié)核者后,就需要進(jìn)行正確有效地進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)隔離可疑的肺結(jié)核者的這些緊急的操作措施, 在依據(jù)可疑的肺結(jié)核者的具體情況決定采取何種藥物、治療干預(yù)措施。在此基礎(chǔ)上, 做好相關(guān)報(bào)告、登記程序, 并對(duì)肺結(jié)核患者身體狀況進(jìn)行追蹤工作。

［1］ 蔣毅,張麗水,趙秀芹, 等. MLVA技術(shù)用于福建105株結(jié)核分枝桿菌基因分型的初步研究.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào).2007,17(03)：173-175.

［2］ 吳長(zhǎng)東,米利古,龔天美, 等. RD105缺失基因檢測(cè)法用于結(jié)核分枝桿菌新疆“北京家族”臨床分離株的鑒定.中國(guó)病原生物學(xué)雜志.2010,15(03):183-184.

［3］ Borna Muller,Lin-Mari de Klerk-Lorist,Marijke M.Henton,et al.Mixed infections of Corynebacterium pseudotuberculosis and non-tuberculous mycobacteria in South African antelopes presenting with tuberculosis-like lesions.Veterinary Microbiology .2011,15(06)：73-75.

［4］ D.J.Stewart,J.A.Vaughan,P.L.Stiles,et al.A long-term bacteriological and immunological study in Holstein-Friesian cattle experimentally infected with Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis and necropsy culture results for Holstein-Friesian cattle, Merino sheep and Angora goats.Veterinary Microbiology .2007,18(02):283-284.

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