高安平

我國(guó)各類(lèi)食物中毒中, 以細(xì)菌性食物中毒占多數(shù)［1］。目前, 我國(guó)對(duì)細(xì)菌性食物中毒的檢測(cè)沒(méi)有系統(tǒng)通用標(biāo)準(zhǔn), 而嚴(yán)格按照食品檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行食物中毒致病菌的檢測(cè), 則檢出時(shí)間太長(zhǎng), 多數(shù)情況下起不到參考用藥的作用, 且很多細(xì)菌無(wú)檢測(cè)國(guó)標(biāo)。在此, 作者運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行快速檢測(cè), 同時(shí)采用直接分離選擇性平板與運(yùn)用增菌液增菌后分離相應(yīng)選擇性平板相結(jié)合的方法, 篩選優(yōu)勢(shì)菌(可疑菌落)進(jìn)行鑒定。三種方法相結(jié)合的檢測(cè)處理過(guò)程加快了檢出速度,提高了檢出率。現(xiàn)具體介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 過(guò)往18起細(xì)菌性食物中毒患者的肛拭、剩余食物等材料114份。

1.2 標(biāo)本采集 肛拭子采集于保存菌種管內(nèi), 剩余食物及其他留樣材料采集于無(wú)菌留樣容器內(nèi)。

1.3 檢測(cè)試劑 PCR儀與PCR細(xì)菌檢測(cè)試劑盒由西安天隆科技有限公司提供； GN腸道增菌液、副溶增菌液、SF增菌液、肉湯、堿性胨水、WS、麥康凱、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、Baird-Parker平板、克氏雙糖、MYP平板等培養(yǎng)基由江蘇省疾病預(yù)防控制中心提供；診斷血清由成都生物制品研究所提供；API生化鑒定系統(tǒng)由梅里埃公司提供。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 實(shí)時(shí)熒光PCR細(xì)菌鑒定 將標(biāo)本用生理鹽水處理,按照試劑盒要求步驟操作, 檢測(cè)現(xiàn)有4種試劑盒細(xì)菌(金葡、副溶、沙門(mén)、大腸、), 2 h后觀(guān)察結(jié)果。

1.4.2 平板分離(直接分離)鑒定 將采集到的食物中毒樣本直接分WS、麥康凱、Baird-Parker平板、克氏雙糖、MYP等選擇性平板, 36℃、18 h培養(yǎng)后, 挑取優(yōu)勢(shì)可疑菌直接先進(jìn)行常規(guī)生化鑒定, 然后進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定和血清凝集試驗(yàn)。

1.4.3 增菌分離鑒定 對(duì)食物中毒樣本在直接分離平板的同時(shí)接種GN腸道增菌液、副溶增菌液、SF增菌液、肉湯、堿性胨水、肉湯等增菌(溫度、時(shí)間按各自要求操作), 增菌后分別分離相對(duì)應(yīng)的選擇性平板, 培養(yǎng)后觀(guān)察平板, 挑取可疑菌落先進(jìn)行常規(guī)生化鑒定, 然后進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定和血清凝集試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 三種方法各自檢出情況 運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR當(dāng)天就檢出副溶血性弧菌6株、沙門(mén)氏菌5株, 金黃色葡萄球菌2株共記13起, 檢出率72.2%。運(yùn)用選擇性平板直接分離鑒定2～4 d檢出副溶血性弧菌4株, 沙門(mén)氏菌4株, 金黃色葡萄球菌1株、蠟樣芽胞菌1株共10起, 檢出率55.6%。運(yùn)用增菌選擇性平板分離3～7 d副溶血性弧菌6株、沙門(mén)氏菌4株,金黃色葡萄球菌2株, 蠟樣芽胞桿菌1株, 陰溝腸桿菌1株、變形桿菌1株共15起, 檢出率83.3%。

2.2 綜合檢測(cè)結(jié)果 18起食物中毒的114份樣本進(jìn)行病原菌檢測(cè), 16起分離到病原菌, 檢出率為88.9%。其中：副溶血性弧菌6株、沙門(mén)氏菌5株, 金黃色葡萄球菌2株, 蠟樣芽胞桿菌1株, 陰溝腸桿菌1株、變形桿菌1株。一天之內(nèi)檢出結(jié)果為13起, 檢出率72.2%；三天內(nèi)檢出結(jié)果共為14起,檢出率77.8%, 占總檢出87.5%。

3 討論

3.1 檢測(cè)的檢出率與及時(shí)性 對(duì)于細(xì)菌性食物中毒標(biāo)本的檢測(cè), 由于國(guó)家沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn), 一般都根據(jù)患者臨床癥狀、流行病學(xué)特征等具體情況而選擇檢測(cè)項(xiàng)目。但實(shí)際情況很復(fù)雜, 涉及到流行病學(xué)分析、現(xiàn)場(chǎng)采樣, 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等多環(huán)節(jié),任何一環(huán)節(jié)的主客觀(guān)因素都可影響致病菌的檢出率與檢出速度, 因而導(dǎo)致眾多不明原因食物中毒［2］。而應(yīng)用本文所述檢測(cè)全過(guò)程, 在檢出率方面該過(guò)程由于多種培養(yǎng)基增菌液同時(shí)應(yīng)用, 避免了檢測(cè)范圍不足, 提高了檢出率；另由于直接分離平板的同時(shí)進(jìn)行了選擇性增菌培養(yǎng), 對(duì)用藥后采集的樣本和細(xì)菌數(shù)量較少的樣本中的病原菌起到了復(fù)蘇、增菌的作用,也有效地降低了漏檢率。在檢測(cè)速度方面應(yīng)用PCR, 2 h就可以得到一部分結(jié)果, 另一方面采用優(yōu)勢(shì)菌可疑菌落直接鑒定,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟, 加快了檢測(cè)速度, 在多數(shù)情況下也能有效的縮短檢測(cè)時(shí)間。能為患者的臨床治療及疫情的控制提供更及時(shí)可靠的依據(jù)。

3.2 三種方法結(jié)合應(yīng)用的必要性 運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)幾小時(shí)內(nèi)就可以檢出致病菌, 而且敏感度很高［3］, 即使微量致病菌或用藥后致病菌死亡了也能檢測(cè)出, 可為臨床治療和疫情控制提供及時(shí)的依據(jù)和指導(dǎo), 但很多基層衛(wèi)生部門(mén)PCR技術(shù)還沒(méi)有開(kāi)展或開(kāi)展有一定的難度, 同時(shí), 由于試劑盒開(kāi)發(fā)的局限性, 檢測(cè)只能限定在已開(kāi)發(fā)的品種范圍內(nèi), 有一定的局限性, 并且單獨(dú)應(yīng)用PCR技術(shù)無(wú)法分離得到致病菌株,不利于更進(jìn)一步的研究。運(yùn)用平板直接分離鑒定優(yōu)勢(shì)菌落,一般情況下3～4 d可以鑒別出致病菌并且可以分離到菌株,基層衛(wèi)生部門(mén)也易于推廣, 但要注意培養(yǎng)基的種類(lèi)要充足,盡可能面廣一些, 但此種直接鑒定容易造成漏檢, 尤其是菌量較少或者用藥后細(xì)菌發(fā)生理化性狀的改變。運(yùn)用增菌后平板分離檢測(cè)鑒定［4］, 此種方法最為可靠, 無(wú)論是食品檢驗(yàn)國(guó)標(biāo)還是通常食物中毒檢測(cè)均以此法為準(zhǔn), 檢出率高出許多,因?yàn)樗鼘?duì)致病菌有個(gè)復(fù)蘇過(guò)程, 但耗費(fèi)時(shí)間要多幾天, 往往提供不了及時(shí)的參考依據(jù), 相對(duì)更準(zhǔn)確但不及時(shí)。當(dāng)三種方法結(jié)合應(yīng)用時(shí), 在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一天之內(nèi)的檢出率就達(dá)到72.2%, 總檢出率達(dá)到88.9%, 明顯優(yōu)于單獨(dú)運(yùn)用任何一種方法。因此, 本文所述檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程具有一定的參考價(jià)值, 有必要對(duì)文述過(guò)程進(jìn)行更進(jìn)一步的優(yōu)化與研究, 望讀者多提寶貴意見(jiàn)。

［1］崔燕.甘肅省2006-2010年食物中毒事件分析.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2012,18(6):10-12.

［2］鞠琳,宋海波,刁平.對(duì)不明原因食物中毒的分析探討.中國(guó)衛(wèi)生監(jiān)督雜志, 2003,10(1):53-54.

［3］Hoorfar J.Rapid detection, characterization, and enumeration of foodborne pathogens.APMIS Suppl, 2011,119(133):1-24.

［4］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法-微生物學(xué)部分.中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010:6.