黃鶴鳴 褚曉凡

暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東深圳 518020

腦缺血后神經(jīng)元凋亡的機制及引起凋亡的兩條細(xì)胞信號傳遞路徑（線粒體路徑及受體介導(dǎo)路徑）已經(jīng)被證實。然而作為腦組織的主要組成成分，腦缺血后膠質(zhì)細(xì)胞的損傷機制及死亡路徑尚未得到足夠的重視。這些星形膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布于灰質(zhì)、白質(zhì)中，對于維持神經(jīng)系統(tǒng)正常功能起到重要作用。因此明確腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞通過什么方式和途徑死亡十分重要，能夠為通過保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞來保護(hù)神經(jīng)元的治療方案提供參考，會給腦缺血后神經(jīng)保護(hù)帶來意外的收獲。

1 脹亡（Oncosis）

目前將細(xì)胞死亡主要分為兩類，一是細(xì)胞凋亡（apoptosis），另一類被稱作偶然性細(xì)胞死亡（accidental cell death）[1]。紊亂的自體吞噬代表在器官重塑及某些特定的病理過程中的第三種細(xì)胞死亡方式。Majno及Joris等提議除了細(xì)胞凋亡之外，大部分情況下的細(xì)胞死亡比較貼切的描述應(yīng)該是偶然性細(xì)胞死亡，即“脹亡”，因為這種細(xì)胞損傷及死亡伴隨著細(xì)胞腫脹。Trump曾經(jīng)對細(xì)胞凋亡、脹亡及壞死進(jìn)行系統(tǒng)性描述[2]。細(xì)胞壞死是細(xì)胞死亡后所發(fā)生的一系列分解反應(yīng)，是細(xì)胞的一種不可逆改變，主要包括核溶解、核固縮、核破裂、核結(jié)構(gòu)喪失及細(xì)胞內(nèi)碎片形成。而凋亡及脹亡是細(xì)胞死亡之前的反應(yīng)性表現(xiàn)，是細(xì)胞的兩種死亡方式。凋亡及脹亡的主要區(qū)別在于細(xì)胞的體積、膜形態(tài)，細(xì)胞進(jìn)入凋亡還是脹亡與所在組織的ATP水平有關(guān)[3]。在細(xì)胞凋亡的過程中，細(xì)胞皺縮，胞突或者生泡，但是細(xì)胞膜的通透性保持不變，細(xì)胞核裂解，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，最終細(xì)胞碎裂成多個凋亡小體[1]。脹亡與細(xì)胞能量耗竭有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)輕度解偶聯(lián)蛋白2（UCP-2）表達(dá)的增加會導(dǎo)致急劇的線粒體膜電位下降，細(xì)胞內(nèi)ATP的合成減少，此時細(xì)胞膜離子泵功能喪失，水及離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體擴張，線粒體腫脹后凝集，核染色質(zhì)結(jié)塊，形成游離細(xì)胞器形成的胞質(zhì)泡，最終細(xì)胞脹亡[1-4]。有研究指出，脹亡，如同凋亡一樣，可以通過細(xì)胞表面受體被激活，比如PORIMIN受體[5]。這兩種死亡方式均是提前被編碼好的，遺傳信息、相關(guān)酶和很多其他因素提前存在于細(xì)胞中。最近關(guān)于細(xì)胞損傷及死亡的研究指出在不可逆性細(xì)胞損傷的末期脹亡占主導(dǎo)地位[6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)在同一個病灶中，細(xì)胞脹亡和凋亡可同時出現(xiàn)并表現(xiàn)出一定的分布特征，血液供應(yīng)相對充足部位由于能量相對富足因此凋亡多見，而血供缺乏的區(qū)域則細(xì)胞脹亡多見。腦缺血中心區(qū)細(xì)胞以脹亡為主，周邊區(qū)以凋亡為主[7]。

脹亡是指致命性細(xì)胞損傷如缺血或許多化學(xué)毒素中毒之后的細(xì)胞死亡前期狀態(tài)[1]。有人提出脹亡性細(xì)胞死亡主要包括3個時期：在第一個時期，細(xì)胞主要因選擇性膜損傷開始進(jìn)入脹亡過程，由于ATP合成障礙導(dǎo)致細(xì)胞能力耗竭，離子泵功能喪失，水和離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，但是在這一時期，細(xì)胞膜的通透性并沒有發(fā)生改變。在第二個時期，細(xì)胞損傷變的不可逆，此期碘化物及臺盼藍(lán)能夠通過細(xì)胞膜，意味著發(fā)生了非選擇性的細(xì)胞膜通透性改變。在第三個時期，細(xì)胞最終出現(xiàn)膜物理性崩解，即發(fā)生了細(xì)胞壞死[4]。由于脹亡伴隨著細(xì)胞內(nèi)外水平衡的破壞，故脹亡與調(diào)節(jié)水平衡的水通道之間的關(guān)系密不可分。近幾年來，越來越多的研究對細(xì)胞脹亡的發(fā)生進(jìn)行了報道，比如：動脈硬化斑塊中的細(xì)胞死亡[8]，由于放射導(dǎo)致的細(xì)胞死亡[9]，由于缺血性心臟病及腦卒中導(dǎo)致的細(xì)胞死亡等[10]。我們之前的研究顯示持續(xù)局灶腦缺血中心區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡方式也是脹亡，其是以細(xì)胞腫脹和核溶解為特征的一種細(xì)胞死亡過程[11]。

2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的脹亡

在大腦中，星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目是其他神經(jīng)元數(shù)目的5倍以上，星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有重要的作用。包括維持細(xì)胞外離子及水平衡，協(xié)助神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞及代謝，組成血腦屏障，參與大腦的修復(fù)過程等[12-13]。當(dāng)嚴(yán)重的腦缺血發(fā)生時，血腦屏障及內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂會導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，激活興奮性氨基酸（excitatory amino acid，EEA）的釋放，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡。因此，阻止星形膠質(zhì)細(xì)胞膨脹或EAA的釋放已經(jīng)成為神經(jīng)保護(hù)的靶點[14]。

有很多研究報道在腦缺血早期出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹的現(xiàn)象。但是，這些腫脹的星形膠質(zhì)細(xì)胞的命運及最終死亡通路目前并不明確，對于腦缺血后的星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡通路究竟是凋亡還是脹亡存在很多不同的觀點。在培育的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，有人認(rèn)為缺血會誘導(dǎo)凋亡[14]。在活體實驗中，在大鼠腦一過性缺血后，在電鏡下很少能夠觀察到凋亡星形膠質(zhì)細(xì)胞的存在[15]。有研究發(fā)現(xiàn)在培育的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，剝奪氧供及葡萄糖后，由于血腦屏障及內(nèi)皮細(xì)胞功能的損害出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞脹亡[16]。但是Gabryel及其同事持有不同的意見，他們認(rèn)為在腦缺血之后的幾秒鐘內(nèi)觀察到的星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹實際上是膠質(zhì)細(xì)胞增殖的早期現(xiàn)象，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞呈星形，GFAP免疫應(yīng)答性增加，伴隨著線粒體數(shù)目增加以及酶介導(dǎo)的、非酶介導(dǎo)的抗氧化活動增強。Ito及其同事將缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹看做細(xì)胞維持內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)定能力的紊亂[17]。在2003年時，有人提出腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡可能與脹亡有關(guān)。采用頸內(nèi)動脈線栓環(huán)扎法建立大鼠持續(xù)局灶腦缺血模型，觀察到在腦組織中無論是缺血中心區(qū)還是缺血邊緣區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞都是以腫脹為主[18]。缺血后3 h，缺血區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞核周邊區(qū)域發(fā)生異染色聚集，核膜完整性的破壞，缺血12 h后出現(xiàn)染色質(zhì)的滲漏。Majno及Joris曾經(jīng)描述脹亡的標(biāo)志性表現(xiàn)是胞漿及細(xì)胞核腫脹，胞漿內(nèi)細(xì)胞器官的破裂及核溶解，而且脹亡常由缺血及毒性物質(zhì)引起，我們研究在持續(xù)局灶腦缺血中心區(qū)域發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的缺血性死亡形態(tài)學(xué)特征類似脹亡，這意味著脹亡可能是缺血性星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡通路[11]。隨后，我們的實驗中星形膠質(zhì)細(xì)胞行缺糖缺氧 （oxygen glucose deprivation，OGD）后，其Na+-K+-ATP酶活性隨OGD時間的延長而降低，流式細(xì)胞儀測的脹亡細(xì)胞比率則隨OGD時間的延長而增多?？梢娒浲黾?xì)胞比率隨Na+-K+-ATP酶活性降低而升高。前期研究已發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的ATP隨OGD時間的延長而逐漸下降，脹亡比率明顯升高，在ODG 3 h內(nèi)脹亡比率小于凋亡，3 h起逐漸超過凋亡，成為星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要死亡方式[19]。

3 APQ4及星形膠質(zhì)細(xì)胞

水通道蛋白（Aquaporins，AQP）是胞膜上控制細(xì)胞水含量的蛋白。1991年，在紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了第一種水通道蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)了位于不同部位的13種AQPs[20]。水主要在跨膜溶質(zhì)濃度梯度的驅(qū)動下通過AQPs進(jìn)行轉(zhuǎn)運。轉(zhuǎn)運的速率主要取決于單個通道的水通透性及胞膜上AQPs的位置及數(shù)量。AQP1、2、4、5、8 只對水有通透性，而 AQP6 還能允許Cl離子通過。AQP3、7、9、10允許甘油及可溶于水的小分子通過。AQP0、11、12的通透性至今仍不明了。在大腦中存在AQP1、4、9。AQP1位于腦室系統(tǒng)的脈絡(luò)叢中，主要參與腦脊液的產(chǎn)生。AQP9主要參與大腦的能量代謝，存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞及一部分神經(jīng)元中。大腦中最多的水通道蛋白是AQP4，AQP4是一種只有30-kDa的疏水跨膜蛋白，是維持大腦水平衡的重要水通道蛋白，水主要在跨膜溶質(zhì)濃度梯度的驅(qū)動下通過AQP4進(jìn)行轉(zhuǎn)移。AQP4在腦水腫，癲癇，肝性腦病及腦腫瘤的病理生理過程中有重要的作用。由于AQP4主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而且水轉(zhuǎn)移的速度主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)或下調(diào)AQP4的表達(dá)，改變其在胞膜的位置及改變其通透性決定的，這使星形膠質(zhì)細(xì)胞成為研究很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病及探索治療這些疾病的新方案的靶點細(xì)胞。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，AQP4主要在3個重要部分表達(dá)比較密集：血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞足突，在血腦屏障功能中有重要作用；在突觸周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞足突，在神經(jīng)遞質(zhì)的清除中有重要作用；與郎飛結(jié)及無髓鞘軸突接觸的足突，在K+的清除中有重要作用。血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突是大腦內(nèi)AQP4表達(dá)的主要位置[21]。

腦水腫分子學(xué)機制的基礎(chǔ)由Igor Klatzo提出，他將水腫分為兩大類，細(xì)胞毒性水腫及血管源性水腫，其中細(xì)胞毒性水腫與細(xì)胞脹亡密切相關(guān)[22]。如同在低鈉血癥及早期腦缺血中所見，細(xì)胞毒性水腫是由于能量耗竭導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水堆積及細(xì)胞失去調(diào)節(jié)其體積的能力。這使水從細(xì)胞間隙進(jìn)入細(xì)胞，從血液進(jìn)入腦實質(zhì)。星形膠質(zhì)細(xì)胞是在細(xì)胞毒性水腫過程中腫脹的主要細(xì)胞類型，星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹也是腦水腫的重要早期狀態(tài)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的AQP4在腦缺血、腦外傷、腫瘤、炎癥及代謝障礙導(dǎo)致的腦水腫中有重要作用。AQP4在細(xì)胞毒性水腫中的重要作用的依據(jù)主要來自于AQP4基因沉默的小鼠中。腹膜內(nèi)注射水會在5 min內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重低鈉血癥，隨后小鼠即因腦腫脹及顱內(nèi)壓增高而死亡。而在AQP4基因沉默的小鼠中低鈉血癥導(dǎo)致死亡的比率顯著下降。這種保護(hù)作用與血腦屏障水通透性下降及進(jìn)入腦實質(zhì)的水的比率下降有關(guān)。AQP4基因沉默的小鼠對其他類型的細(xì)胞毒性腦水腫易感性也較低，如細(xì)菌性腦膜炎[23]。胞漿膜上的AQP4蛋白與聚集的細(xì)胞內(nèi)蛋白綁定，如α-肌氧結(jié)合蛋白。有趣的是，α-肌氧蛋白基因沉默的小鼠也不易發(fā)生局灶性腦缺血引起的腦水腫[24]。上述研究提示抑制AQP4表達(dá)或功能的藥物能夠限制人類細(xì)胞毒性腦水腫。但是，AQP4基因敲除會使血管源性腦水腫加劇。在細(xì)胞毒性水腫中，AQP4基因敲除會使水進(jìn)入大腦的速率降低，但是在血管源性水腫中，AQP4敲除還會使水從大腦中轉(zhuǎn)移出的速率下降。因此，AQP4在轉(zhuǎn)基因小鼠中過度表達(dá)會加劇細(xì)胞毒性腦腫脹[25]。

4 AQP4的調(diào)節(jié)

大腦內(nèi)AQP4的位置及數(shù)量都被緊密調(diào)節(jié)。交互作用蛋白，缺氧，滲透壓改變，氨及轉(zhuǎn)錄信息均可以對AQP4進(jìn)行長期調(diào)節(jié)；AQP4的短期調(diào)節(jié)主要依賴于受體，大部分都是G蛋白偶聯(lián)的胞膜受體，這些受體的激活劑包括肽類激素、類前列腺素、兒茶酚胺及氨基酸，受體及配體相互作用后發(fā)生磷酸化及去磷酸化。

有研究表明缺氧被認(rèn)為能夠影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的AQP4表達(dá)。冠狀動脈阻塞，導(dǎo)致全腦缺氧，據(jù)報道缺氧/缺血24 h后，會出現(xiàn)AQP4表達(dá)下降[26]。在大腦中動脈阻塞過程中，尤其在有血管性損傷的部位，氧供沒有恢復(fù)的區(qū)域，AQP4的表達(dá)會快速下降[24]。但是，當(dāng)細(xì)胞再次獲得氧供時，AQP4表達(dá)的下調(diào)可以被逆轉(zhuǎn)，再度給氧9～12 h后，出現(xiàn)AQP4的明顯表達(dá)增加[27]。在新生的動物中，短暫的3.5 min的窒息之后給氧6 h會出現(xiàn)全腦的AQP4表達(dá)下降[28]。而成年大鼠系統(tǒng)性缺氧2 h隨后恢復(fù)氧供9 h，會產(chǎn)生腦干AQP4表達(dá)增加[29]。對卒中后死亡的患者進(jìn)行尸檢發(fā)現(xiàn)，缺血灶周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4表達(dá)增加[30]。在體內(nèi)試驗中，缺氧對AQP4表達(dá)的作用不僅基于缺氧的范圍及程度，還與重新獲得氧供的范圍、重新獲得氧供的時間有關(guān)。這也許能夠解釋不同的缺氧模型中，如卒中，窒息或TBI中AQP4表達(dá)的差異。

5 結(jié)論

眾所周知大腦內(nèi)水平衡主要通過水通道蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)，而AQP4是星形膠質(zhì)細(xì)胞主要的水通道蛋白，所以AQP4與星形膠質(zhì)細(xì)胞的脹亡有必然的聯(lián)系。缺血缺氧，使AQP4的表達(dá)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)外水平衡被破壞，發(fā)生細(xì)胞脹亡。AQP4在細(xì)胞毒性水腫有重要的作用，AQP4究竟如何改變而導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞脹亡均有待進(jìn)一步研究，能夠為治療腦缺血等疾病的治療發(fā)現(xiàn)新的靶點。

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