劉 賀 陳 偉 王軼楠 江仲超 張顏博 王金成 常 非

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科，吉林 長春 130033)

卵清蛋白誘導的兔類風濕關節(jié)炎模型的建立及評估

劉 賀 陳 偉 王軼楠1江仲超 張顏博 王金成 常 非

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科，吉林 長春 130033)

目的建立并評估卵清蛋白(OVA)誘導的兔類風濕關節(jié)炎(RA)模型。方法于家兔肩胛間區(qū)的5個部位進行皮下注射OVA，每周1次，連續(xù)3 w，對RA組進行致敏，注射2 w后，在兔雙側關節(jié)腔內注射OVA建立RA模型。對照組以同樣方法注射等量的生理鹽水。建模后每周分別用千分游標卡尺和電子體溫計測量關節(jié)直徑和關節(jié)表面皮膚溫度;第1、4、8周采用ELISA試劑盒檢測各組家兔外周血清中的IL-1、TNF-α和抗OVA IgG水平;于建模后第1、4、8周處死家兔，取腹股溝淋巴結，用不同濃度OVA刺激淋巴細胞增殖，檢測淋巴細胞對特異性抗原的反應;HE染色觀察膝關節(jié)滑膜增生、軟骨破壞程度及缺損周圍組織炎性細胞浸潤情況。結果RA組家兔關節(jié)腔注射OVA后1 w，關節(jié)直徑明顯增大，表面皮膚溫度明顯升高，隨后逐漸降低至穩(wěn)定的水平，但仍明顯高于對照組;在關節(jié)腔注射抗原后第1、4、8周，RA組血清中IL-1、TNF-α和抗OVA IgG水平較對照組均顯著升高(P＜0.01);RA組淋巴細胞增殖實驗與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);RA組家兔關節(jié)滑膜大量增生，第8周時軟骨破壞明顯;組織切片可見滑膜組織大量增生，炎癥細胞浸潤，軟骨層破壞。結論OVA誘導的兔RA模型能夠很好地模擬人RA病理過程，可成為研究RA的理想的動物模型。

卵清蛋白;類風濕關節(jié)炎

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種常見的慢性、炎性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，以關節(jié)和關節(jié)周圍組織非化膿性炎癥為主要特征，影響著0.05% ～1%的人群〔1〕。目前，研究RA的常用動物模型仍是弗氏佐劑誘導的AA模型〔2〕、Ⅱ型膠原誘導的CIA模型〔3〕，這兩種模型適用于小鼠和大鼠。兔的膝關節(jié)較大，易于進行藥品注射及細胞移植治療，且它與人的手足小關節(jié)大小相近，對指導RA好發(fā)部位的治療很有意義〔4〕。卵清蛋白(OVA)作為一種外源性抗原已被廣泛應用于主動致敏來建立如變應性鼻炎、支氣管哮喘的動物模型等〔5，6〕。OVA可以引起嗜酸性細胞、肥大細胞以及淋巴細胞的集聚，較好地模擬了免疫性疾病的微環(huán)境。本研究通過關節(jié)腔內注射OVA誘導兔RA模型〔7〕，并對其進行評估。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 家兔30只，10周齡，體重(1.8±0.2)kg，購自吉林大學醫(yī)學院基礎實驗動物中心，動物合格證號:SYXK(吉)2007-0012。

1.2 RA模型建立 1 ml OVA乳劑(含OVA 10 mg)，于兔肩胛間區(qū)的5個部位進行皮下注射，每周1次，連續(xù)3 w，對照組于同樣部位注射等量的生理鹽水。注射2 w后，將家兔固定于手術臺上，對雙膝關節(jié)部位進行除毛，酒精消毒，在脛骨結節(jié)最高點與髕骨下緣連線之中點的髕韌帶兩側、垂直于皮膚進針1 cm(穿破關節(jié)囊時有突破感)，雙膝各注射0.5 ml OVA乳劑(含OVA 5 mg)，對照組注射等量的無菌生理鹽水。

1.3 RA模型的鑒定及評價

1.3.1 一般體征觀察 家兔的體重、飲食量、尿便、毛發(fā)光澤、活動狀態(tài)以及關節(jié)外觀改變。

1.3.2 家兔關節(jié)直徑和關節(jié)表面溫度的檢查 在建模前、建模后，每隔1 w，用電子體溫計測量家兔髕韌帶中點關節(jié)皮膚表面體溫，將兔膝關節(jié)屈曲90°，用千分游標卡尺在兔脛骨結節(jié)最高點與髕骨下緣連線之中點平面測量關節(jié)直徑。

1.3.3 血液學檢查 在建模后第1、4、8周耳緣靜脈取血，離心上層血清，－20℃保存?zhèn)溆?。檢測白細胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α以及抗OVA抗體(抗OVA IgG)，具體步驟按ELISA試劑盒說明操作。

1.3.4 特異性抗原淋巴細胞增殖實驗 在建模后第1、4、8周時隨機處死對照組和RA組家兔各5只，在無菌條件下，取腹股溝淋巴結，研磨計數(shù)鋪板，分別加入 0，0.2，1，5，25 μmol/L 的OVA溶液，培養(yǎng)24、48 h，MTT法測淋巴細胞增殖。

1.3.5 關節(jié)病理標本制作和觀察 剪除髕骨和相關肌肉及韌帶，用擺鋸將遠端股骨和近端脛骨截斷后固定于4%的多聚甲醛中1 w，放于0.5 mol/L的乙二酸四乙酸溶液中脫鈣，至針頭能夠刺入為止。包埋后用切片機切成5μm厚的切片;HE染色觀察滑膜增生、周圍組織炎性細胞浸潤、軟骨和軟骨下骨破壞情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩樣本之間進行t檢驗。

2 結果

2.1 一般體征及體重的變化 與對照組相比，RA組家兔在免疫初期，飲食量、精神狀態(tài)、自主活動等均無明顯改變。隨著免疫次數(shù)的增多，動物食欲減退、體重增長減慢、毛色稀疏發(fā)黃、活動減少;在關節(jié)腔注射OVA之后關節(jié)嚴重腫脹，隨著時間的延長，出現(xiàn)炎癥小結，后肢關節(jié)硬化、并逐漸喪失運動功能。

2.2 家兔關節(jié)直徑和關節(jié)表面溫度的變化 與對照組相比，RA組在膝關節(jié)注射抗原后，關節(jié)直徑明顯增大(P＜0.01);建模后第1周關節(jié)直徑增大的峰值期，隨后有所降低并趨于穩(wěn)定。RA組在膝關節(jié)注射抗原后，與對照組相比，關節(jié)表面溫度明顯升高(P＜0.01)，建模后第1周為皮溫升高的峰值期，隨后有所降低并趨于穩(wěn)定。見圖1。

2.3 家兔血清中的IL-1、TNF-α和抗OVA IgG的ELISA的檢測結果 與對照組相比，建模后第1、4、8周RA組血清中IL-1、TNF-α和抗OVA IgG水平有明顯升高(P＜0.01)。見表1。

表1 兩組在不同時間點IL-1、TNF-α、抗OVA IgG的比較(±s，n=5，ng/L)

表1 兩組在不同時間點IL-1、TNF-α、抗OVA IgG的比較(±s，n=5，ng/L)

與RA組比較:1)P＜0.01

1 w 4 w 8 w 抗OVA IgG組別 IL-1 TNF-α 1 w 4 w 8 w對照組 62.40±15.221)72.50±13.421)70.49±12.211)319.03±53.971)330.04±55.621)335.87±42.741)152.21±21.241)160.34±18.951)145.47±25.531)1 w 4 w 8 w±33.64 278.87±36.09 282.25±32.55 RA組 154.58±22.43 133.63±31.32 126.63±36.25 460.96±44.78 477.04±54.68 496.47±43.02 235.26

圖1 家兔關節(jié)直徑和表面溫度變化

2.4 OVA刺激淋巴細胞增殖 淋巴細胞在較高OVA濃度(＞1μmol/L)刺激時出現(xiàn)細胞增殖差異，培養(yǎng)24和48 h后RA組和對照組相比淋巴細胞增殖明顯增多(P＜0.05)。見圖2。

2.5 家兔關節(jié)外觀的變化 大體觀察可見對照組兔關節(jié)滑膜亮白，層次較少，軟骨表面光滑透明，無缺損;RA組兔關節(jié)滑膜大量增生，顏色灰白，層次增多，軟骨色澤變暗，第8周可見明顯的軟骨缺損。見圖3。

圖2 不同濃度OVA刺激淋巴細胞24和48 h增殖情況

2.6 滑膜組織學觀察結果 組織切片可見對照組兔膝關節(jié)滑膜內膜細胞正常，無增生和炎性細胞浸潤(圖4A)。RA組可見滑膜內膜細胞增生肥大，炎癥細胞浸潤，其中以T淋巴細胞為主，滑膜血管增生(圖4B)?；そM織內見Russell小體(空心箭頭)形成，滑膜細胞增生導致形成多核巨細胞(實心箭頭)(圖4C)?；ち馨图毎奂森h(huán)形，形成淋巴濾泡，淋巴小結周圍可見漿細胞套狀浸潤(圖4D)。米粒樣小體黏附在滑膜上、從滑膜上長出或游離在關節(jié)腔內(黑色箭頭所示)(圖4E和4F)。

2.7 軟骨HE染色 正常軟骨表面光滑，表面無血管翳包裹，軟骨細胞充實，軟骨層較厚(圖5A)。RA組軟骨被增生的滑膜和纖維組織包裹(圖5B)，關節(jié)軟骨層變薄，發(fā)生軟骨溶解，軟骨細胞核和細胞體消失，呈現(xiàn)白色是軟骨溶解標志，可以通過蒼白的染色和軟骨陷窩的擴張得到證實(圖5C)。在RA中，由血管、炎性細胞和增生的成纖維細胞組成的肉芽組織侵入和越過關節(jié)軟骨，血管翳在關節(jié)內和關節(jié)周圍生長，隨后從關節(jié)軟骨表面越過，并緊緊包裹關節(jié)軟骨和軟骨下骨(圖5D、圖5E)。嚴重者軟骨可完全溶解達到軟骨下骨(圖5F)。

圖3 兩組家兔大體觀察

圖5 兩組軟骨HE染色

3 討論

小鼠體積較小，且在形態(tài)學上與人類相差較遠，因此，在某些特殊的實驗中，與人類親緣關系較近的或體型較大的動物往往會更適合。RA是淋巴細胞、中性粒細胞和細胞因子之間互相介導的免疫反應，最終導致不可逆的嚴重的炎癥性組織損傷，炎性組織逐漸覆蓋關節(jié)面，形成所謂的血管翳，關節(jié)軟骨甚至軟骨下骨均被破壞〔8〕。雞OVA誘導家兔RA模型的機制是通過反復皮下注射雞OVA，使體內產生抗OVA抗體，隨后在關節(jié)腔內再次注射抗原，抗體與抗原結合后沉積于關節(jié)軟骨和滑膜上〔9〕，刺激機體的補體系統(tǒng)和細胞免疫，而T淋巴細胞和細胞因子TNF-α、IL-1在介導RA炎癥反應及組織損傷過程中起著重要的作用〔10〕，目前認為IL-1是參與RA進展期關節(jié)破壞的典型前炎癥細胞因子，而TNF-α參與RA的炎癥反應過程，在臨床上，RA患者血清中炎性細胞因子IL-1和TNF-α水平有明顯的升高〔11〕。本研究說明在RA進展中，B淋巴細胞被活化并分泌抗體。OVA對家兔的淋巴細胞產生了特異性刺激，T淋巴細胞和B淋巴細胞的共同參與了關節(jié)炎的進展，與臨床上RA患者表現(xiàn)一致〔12〕。

OVA和弗氏完全佐劑所制作的乳劑誘導關節(jié)炎模型的關鍵在于乳劑的乳化程度是否完全，滴于冰水中完全不擴散是檢測乳劑是否成功的指標，并且在乳劑制備后應盡早注入皮下，以免長期放置導致OVA與佐劑分離，影響模型成功率。完全乳化的乳劑能在皮下緩慢釋放抗原，對動物進行長時期的刺激作用，延長致敏時間，可以有效、穩(wěn)定地激活機體的免疫反應，從而提高動物模型制備的穩(wěn)定和可靠性。本實驗制備的模型與人類臨床上的RA病理機制相符，且致敏率高，整個過程中無需麻醉，評估方法簡單可靠。

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Establishment and evaluation of rabbit rheumatoid arthritismodel induced by ovalbum in

LIU He，CHEN W ei，WANG Yi-Nan，et al.
Department of Osteology，China-Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun 130033，Jilin，China

ObjectiveTo establish and evaluate rabbit rheumatoid arthritis(RA)model induced by ovalbumin(OVA).M ethods

After continuous subcutaneous injection of OVA at 5 points of scapular area each week to sensitize RA group rabbits for three weeks，2 weeks later after sensitization，OVA was injected into the intra-articular of each knee to induce RAmodels.And control group were given the same amount of saline in the sameway.The jointdiameter and surface skin temperature changed withmicrometer caliper and electronic clinical thermometer weekly;IL-1，TNF-αand anti-OVA IgG levels in the serum were determined with ELISA Kits at first，fourth and eighth week.Rabbitswere sacrificed at the second，fourth and eighth week after articular injection to obtain inguinal lymph nodes stimulated by different concentrations of OVA for lymphocyte proliferation test to detect lymphocyte responses to specific antigen.The knees and synovial tissue were removed to observe synovialhyperplasia，cartilage destruction and inflammatory cells infiltration by HE staining.ResultsThe joint diameter and surface skin temperature of RA group increased significantly after articular injection for a week，then gradually reduced to a stable level，but still significantly higher than those of control group.The IL-1，TNF-αand anti-OVA IgG levels in the serum of RA group were significantly higher than those of control group at the first，fourth and eighth week(P ＜0.01);Lymphocyte proliferation test also indicated statistically significant difference(P＜0.05)between the two groups.Macroscopic observation showed obvious synovial hyperplasia and cartilage destruction sacrificed at eighth week.Tissue sections showed synovial tissue hyperplasia，inflammatory cells infiltration and cartilage destruction.ConclusionsRA model induced by OVA can imitate the pathological process of human RA very well，offering an ideal animal model of RA.

Ovalbumin;Rheumatoid arthritis

R593.22

A

1005-9202(2013)12-2799-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.031

國家自然科技基金面上項目(No.81171681);高等學校博士學科點專項科研基金(新教師基金)(No.20090061120081)

1 吉林大學第一醫(yī)院轉化醫(yī)學研究院

常 非(1975-)，男，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事足踝外科及軟骨再生研究。

劉 賀(1988-)，男，碩士，主要從事軟骨再生及類風濕關節(jié)炎研究。

〔2013-01-19收稿 2013-04-07修回〕

(編輯 張 慧)