魏利杰，徐琳，王錦卓(.吉林省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林長(zhǎng)春300;.吉林省長(zhǎng)春市婦產(chǎn)醫(yī)院麻醉科，吉林長(zhǎng)春300)

正常婦女，在雌激素的影響下陰道上皮細(xì)胞增生，表層細(xì)胞角化，陰道酸堿度保持在4～5，使適應(yīng)堿性的病原菌的繁殖受抑制，頸管黏液呈堿性，使適應(yīng)酸性病原菌的繁殖受抑制，當(dāng)此自然防御功能受破壞時(shí)，易導(dǎo)致陰道炎。寄生于陰道內(nèi)的細(xì)菌包括革蘭陽(yáng)性需氧菌及厭氧菌，各種細(xì)菌通過(guò)黏附機(jī)制生長(zhǎng)于陰道黏膜，陰道菌之間相互拮抗、相互依賴(lài)，并受機(jī)體內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)和陰道內(nèi)環(huán)境的影響而維持著動(dòng)態(tài)平衡，在正常菌群中，以乳酸桿菌占優(yōu)勢(shì)，陰道上皮的糖原經(jīng)乳酸桿菌作用分解成乳酸，使陰道局部呈弱酸環(huán)境，抑制其他細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，從而維持陰道正常菌群。然而由于個(gè)體激素水平的巨大差異、生活方式、藥物使用等方面的不同，易導(dǎo)致細(xì)菌的抗藥性和機(jī)體的菌群失調(diào)，進(jìn)而使得陰道炎性反應(yīng)遷延反復(fù)[1]。目前對(duì)于各種原因所致陰道炎的治療方法仍以抗菌藥物為主，未注重對(duì)陰道內(nèi)環(huán)境的恢復(fù)和調(diào)整，且易造成病情反復(fù)。故此，對(duì)維持陰道的酸堿平衡，日益引起重視。目前資料表明，非特異性細(xì)菌性陰道炎發(fā)生可能與陰道乳酸桿菌數(shù)量的減少或缺失相關(guān)[2]。本文通過(guò)試驗(yàn)研究觀察了乳酸桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)女性陰道常見(jiàn)致病菌抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來(lái)源:乳酸桿菌、腸球菌、銅綠假單胞菌、傷寒桿菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌均由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院微生物教研室惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑:IMDM(美國(guó)GIBCO)，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(杭州天和微生物制劑有限公司)、小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所生產(chǎn))，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

乳酸桿菌代謝產(chǎn)物的制備將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳酸桿菌接種于LC液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，當(dāng)濃度達(dá)到1×1010個(gè)/ml時(shí)濾器除菌，用無(wú)菌瓶分裝濾液分裝，置4℃冰箱備用。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基的制備取滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注于直徑10 cm的無(wú)菌平皿內(nèi)，控制培養(yǎng)基的厚度0.5～0.6 cm，冷卻后置4℃冰箱備用。

細(xì)菌液的制備取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、傷寒桿菌和腸球菌分別接種于10 ml的無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后取出，配制成1×106個(gè)/ml菌液，置4℃冰箱備用。

陰道上皮細(xì)胞的制備取25位年齡20～50歲，婦科檢查正常，月經(jīng)周期10～14 d的婦科門(mén)診就診者的陰道上皮細(xì)胞。用刮板輕輕刮去陰道后壁上段細(xì)胞，懸浮于RPMI1640培養(yǎng)液中，反復(fù)吹打，離心5 min，重復(fù)3次。使細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 ml置CO2孵育箱中培養(yǎng)6 h，用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次。

乳酸桿菌對(duì)各種常見(jiàn)致病菌抑菌環(huán)試驗(yàn)研究取制備好的培養(yǎng)板，將配置好的菌液0.5 ml滴加在培養(yǎng)板中央，用無(wú)菌L棒將細(xì)菌涂均，每種細(xì)菌做3塊培養(yǎng)板，每塊培養(yǎng)板均勻放置4個(gè)無(wú)菌的藥敏杯，試驗(yàn)組:其中2個(gè)藥敏杯中加入0.5 ml制備好的乳酸桿菌代謝產(chǎn)物;對(duì)照組:另2個(gè)藥敏杯中加入0.5 ml無(wú)菌生理鹽水。分別做記號(hào)標(biāo)志，放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

乳酸桿菌對(duì)各種常見(jiàn)致病菌陰道上皮細(xì)胞黏附抑制試驗(yàn)研究取上述制備好陰道上皮細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板，第1～3行每孔分別加入乳酸桿菌代謝產(chǎn)物濾液0.5 ml，為試驗(yàn)組，第4～6行不加，為對(duì)照組。從第1行至第6行每孔分別加入0.2 ml制備好的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、腸桿菌和白色念珠菌菌液，置CO2孵育箱培養(yǎng)2 h，用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:每次試驗(yàn)都重復(fù)3次，數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來(lái)表示，比較分析用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

乳酸桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)陰道常見(jiàn)致病菌的抑菌情況分析采用抑菌環(huán)試驗(yàn)，觀察此產(chǎn)物對(duì)腸桿菌、大腸埃希菌、胞菌、銅綠假單傷寒桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌等常見(jiàn)致病菌的抑制生長(zhǎng)情況，同時(shí)分別提取3塊各種菌試驗(yàn)培養(yǎng)板的抑菌環(huán)大小的平均值作為試驗(yàn)結(jié)果，并與對(duì)照組相對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 乳酸桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)常見(jiàn)致病菌的抑菌環(huán)直徑分析(±s)

表1 乳酸桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)常見(jiàn)致病菌的抑菌環(huán)直徑分析(±s)

菌株strains抑菌環(huán)直徑(cm)試驗(yàn)組1.7±0.20.0銅綠假單胞菌2.7±0.60.0金黃色葡萄球菌2.8±0.40.0傷寒桿菌1.5±0.10.0腸球菌0.00.0白色念珠菌生理鹽水對(duì)照組大腸埃希菌0.00.0

乳酸桿菌代謝產(chǎn)物抑制各種常見(jiàn)致病菌與陰道上皮細(xì)胞黏附情況分析采用革蘭染色法，鏡下觀察乳酸桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、腸桿菌和白色念珠菌與陰道上皮細(xì)胞的黏附抑制情況。各孔隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以黏附10個(gè)以上細(xì)菌為黏附陽(yáng)性，取各孔平均數(shù)為試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乳酸桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)常見(jiàn)致病菌與陰道上皮細(xì)胞黏附能力的抑制作用分析

3 討論

健康女性陰道內(nèi)存在許多寄生細(xì)菌，包括需氧菌和厭氧菌。主要的革蘭陽(yáng)性菌有:乳酸桿菌、棒狀桿菌、腸球菌等;主要的革蘭陰性菌有:大腸埃希菌、加德納菌、動(dòng)彎桿菌等其中許多成員具有潛在的致病作用[2]。本研究結(jié)果表明，乳酸桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和傷寒桿菌有抑菌作用，其抑菌環(huán)直徑分別為(1.7±0.2)cm、(2.7±0.6)cm、(2.8±0.4)cm和(1.5±0.1)cm，與對(duì)照組抑菌環(huán)直徑為0相比具有明顯差異(P﹤0.05)，這一結(jié)果為臨床應(yīng)用乳酸桿菌及其制劑提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)腸球菌和白色念珠菌未見(jiàn)明顯抑制效果，因此抑菌環(huán)試驗(yàn)尚不能闡述乳酸桿菌的抗病機(jī)理，推測(cè)乳酸桿菌對(duì)腸球菌和白色念珠菌的抑制作用可能與代謝產(chǎn)物直接殺菌無(wú)關(guān)，是否存在其他抑制的間接作用仍需其他試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證研究。

陰道的酸性環(huán)境是維持陰道的內(nèi)環(huán)境平衡的重要條件，乳酸桿菌產(chǎn)生的乳酸可抑制類(lèi)桿菌及其他需氧菌、兼性厭氧菌的生長(zhǎng)[3]。本研究顯示乳酸桿菌代謝產(chǎn)物抑制大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、傷寒桿菌、腸桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌對(duì)陰道上皮細(xì)胞的黏附作用效果好，可以明顯地降低它們與陰道上皮細(xì)胞黏附數(shù)量，試驗(yàn)組與陰道上皮細(xì)胞黏附數(shù)分別為29.4±4.9、36.7±5.3、29.1±4.1、22.5±3.2、24.7±2.9和43.1±3.9，明顯低于對(duì)照組的黏附陰道上皮細(xì)胞數(shù)目的91.8±12.1、90.1±10.3、95.6±13.2、90.6±9.8、87.5±10.1和94.9±13.2，兩組相比較具有顯著性差異(P﹤0.05)。這一結(jié)果提示，乳酸桿菌對(duì)上述常見(jiàn)致病菌與陰道上皮細(xì)胞的黏附具有明顯的抑制作用。根據(jù)這一結(jié)果推測(cè)，高濃度的乳酸桿菌代謝產(chǎn)物可能會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制陰道病原菌的黏附能力，或從某一環(huán)節(jié)阻斷病原菌對(duì)陰道上皮細(xì)胞的黏附能力，故應(yīng)用的乳酸桿菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)陰道病原菌有抑制作用，但是否還有抑制其他因子的分泌、存在濃度抑制等需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究來(lái)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究證實(shí)乳酸桿菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)白色念珠菌、銅綠假單胞菌、腸桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等感染所致的女性陰道炎性反應(yīng)有較好的治療作用和預(yù)防功能，與目前以乳酸桿菌為主導(dǎo)的較健康的陰道微生態(tài)有利于提高陰道對(duì)各種病原微生物抗感染能力的相關(guān)報(bào)道一致，并且乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物沒(méi)有不良反應(yīng)，為陰道炎的治療研究提供了一種新的有效方法。

[1] 康白，呂虎，傅曉麗.對(duì)DM8909菌株治療菌群是條性陰道病作用機(jī)制的研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2001，13(4):192.

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