韓蕾，趙國建，李雪姣，邰源臨，魏學智，*

（1.山西師范大學生命科學學院，山西臨汾041004；2.山西師范大學工程學院，山西臨汾041004 3.水利部水土保持植物開發(fā)管理中心，北京100083）

蕤核（Prinsepia uniflora Batal.）又名蕤李子（救荒本草），扁禾木（樹木分類學），茹茹（山西）等，屬薔薇科（Rosaceae） 李亞科（Prunnoideae focke） 扁核木屬（Prinsepia Royle）的落葉灌木。主要分布于河南、山西、陜西、內(nèi)蒙古等省區(qū)，生長在900 m～1 100 m 山坡陽處或山腳下，是喜光、耐旱、耐寒的陽性樹種。果實風味獨特，酸甜適口，果仁可入藥，養(yǎng)肝明目，是一種具有經(jīng)濟價值野生植物資源[1]。黃酮類化合物（flavonoids）是高等植物體內(nèi)普遍存在的一大類重要的次生代謝產(chǎn)物，對人類的衰老、腫瘤、心血管等疾病的預防和治療具有重要意義[2-3]。

目前有關蕤核黃酮類物質(zhì)的研究報道甚少[4]，對總黃酮分離純化的工藝條件未見報道，因此本試驗選取4 種大孔樹脂進行靜態(tài)吸附解吸及靜態(tài)動力學研究，篩選出最佳的樹脂類型并確定其最佳工藝條件，為蕤核葉總黃酮的分離純化奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料蕤核葉片，于2011年8月采自山西省臨汾市龍祠村。葉片除雜、洗凈、烘干，用粉碎機粉碎，過60 目篩置于塑封袋中備用。

1.2 儀器

RE-52A 型旋轉蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；SHB-Ⅱ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；721 型可見分光光度計：上海天普分析儀器有限公司；101-3BS 型電熱鼓風干燥箱：金壇市榮華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樹脂的預處理

用無水乙醇浸泡24 h，使樹脂充分溶脂，以濕法裝柱，乙醇洗脫至流出液乙醇-水（1 ∶5）不成白色渾濁為止，然后用蒸餾水洗至無醇味，取出樹脂備用[5]。

1.3.2 蕤核葉總黃酮提取液制備和含量測定

取葉片粉末適量，按料液比1 ∶25，體積分數(shù)為60 %乙醇在70 ℃超聲波儀器中，輔助提取50 min 后抽濾，重復3 次，合并濾液濃縮，用石油醚反復萃取直到醚相基本無色，去除色素等脂溶性的雜質(zhì)，水相用3 倍～4 倍量95 %乙醇沉淀去除多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)[6]。

測定含量參照梁曉華[7]的方法，以蘆丁為標準品，510 nm 處測吸光值，繪制標準曲線，得到回歸方程：A=0.011 3C+0.000 5（R2=0.999 8），式中：C 為總黃酮濃度，（mg/L）；A 為吸光度。

1.3.3 靜態(tài)吸附與解析

準確稱取處理好的4 種樹脂1 g 置于100 mL 錐形瓶中，加入黃酮提取液45 mL,封口后，室溫下振蕩24 h，使其充分吸附后，吸取上層液按1.3.2 的方法測定黃酮濃度。將靜態(tài)吸附飽和后的4 種樹脂抽濾干，轉至另4 個干凈的100 mL 錐形瓶中，加入60%乙醇溶液45 mL，封口后，室溫下振蕩解吸24 h，同法測定解吸液中黃酮濃度。計算各大孔樹脂對蕤核葉片黃酮的靜態(tài)吸附量、解吸率[8]。

吸附量（mg/g）=（提取液濃度-吸附后剩余溶液濃度）×上樣液體積/樹脂質(zhì)量

解吸率=[解吸液濃度×洗脫液體積/（提取液濃度-吸附后剩余溶液濃度）×上樣液體積]×100%

1.3.4 靜態(tài)吸附動力學分析

準確稱取處理好的大孔樹脂1.00 g 于100 mL 錐形瓶中，加入45 mL 提取液后振蕩至吸附平衡，每隔1 h 取上層液測定吸光值，繪制吸附動力學曲線。

1.3.5 最適樹脂分離純化黃酮的工藝條件

1.3.5.1 提取液pH 的篩選

取2 g 預處理后的樹脂于100 mL 錐形瓶中，分別加入pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的提取液,吸附飽和后測定黃酮的濃度，計算不同pH 條件下樹脂的吸附量。

1.3.5.2 上樣液濃度的篩選

取2 g 預處理后的樹脂于100 mL 錐形瓶中，依次加入50 mL 不同濃度的提取液1、2、3、4、5 mg/mL，充分吸附后測定黃酮濃度。

1.3.5.3 上樣量的篩選

取2 g 預處理后的樹脂于100 mL 錐形瓶中，分別加入10、16、20、26、30 mL 的提取液，充分吸附后測定黃酮的濃度。

1.3.5.4 洗脫劑濃度的篩選

將經(jīng)過預處理的樹脂濕法裝柱，按照已確定的最佳條件上樣，充分吸附后，蒸餾水洗至無糖反應（Molish 反應），用濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液洗脫，洗脫流速為2 mL/min，測定黃酮的濃度。

1.3.5.5 洗脫劑用量的篩選[9]

按照最佳條件上樣、吸附和洗脫，洗脫速度為2 mL/min，每收集0.5 BV 體積測定其黃酮的濃度，共收集6 BV 體積，繪制洗脫曲線，確定洗脫劑的用量。

2 結果與分析

2.1 4 種樹脂的靜態(tài)吸附率和解析率

4 種樹脂的靜態(tài)吸附率和解析率，結果見表1。

表1 不同型號樹脂飽和吸附率和解析率Table 1 Adsorption capacity and desorption rate of different kinds of macroporous resins

大孔吸附樹脂的純化是利用特殊的吸附劑-大孔吸附樹脂的吸附性和分子篩相結合的原理，從提取液中有選擇地吸附住有效成分，去除雜質(zhì)[10-11]。不同的樹脂對于黃酮的純化效果不同，為了更大限度的回收有效成分黃酮，考察樹脂的吸附率和解析率尤為重要。由表1 可知，大孔樹脂AB-8 吸附率為76.96%，DM-130 吸附率為75.44%，兩種樹脂的吸附效果接近，從解析率來看，AB-8 的解析率明顯的高于另外3 種樹脂，達到81.93%。基于試驗結果和綜合考慮，初步確定AB-8 大孔樹脂是純化蕤核葉總黃酮的最佳樹脂。

2.2 靜態(tài)吸附動力學曲線

對大孔樹脂進行吸附動力學研究，結果見圖1。

圖1 靜態(tài)動力學曲線Fig.1 Static adsorption curvc of total flavonoids

由圖1 可知，4 種樹脂在4 h 內(nèi)吸附速度較快，4 h～5 h 基本達到飽和，5 h 后黃酮濃度趨于平穩(wěn)，其中大孔樹脂AB-8 對蕤核葉黃酮的吸附能力最強，結合上述樹脂的吸附率和解吸率，適合純化黃酮類物質(zhì)不僅有較好的吸附能力，而且有較好的解吸能力，同時節(jié)約時間，在工業(yè)化生產(chǎn)中能提高生產(chǎn)效率。所以選擇AB-8 型大孔樹脂作為純化蕤核葉總黃酮的樹脂。

2.3 AB-8 純化蕤核葉總黃酮工藝的確定

2.3.1 提取液pH 的篩選

黃酮類化合物是多羥基酚類，成弱酸性，在弱酸或酸性條件下吸附效果較好[12]。提取液pH 的不同，樹脂對蕤核葉總黃酮的吸附效率也不同，結果見圖2。

圖2 提取液pH 對吸附量的影響Fig.2 Effect of pH value sample solution on adsorption

由圖2 可知，提取液的pH 為4 時吸附率最高，隨著pH 的增大，吸附率降低，所以確定提取液pH 為4時吸附效果最好。

2.3.2 上樣液濃度的篩選

上樣液濃度對吸附量的影響見圖3。

從圖3 上樣液濃度對吸附量的影響曲線中可以看出，隨著蕤核葉總黃酮提取液濃度的增加，樹脂的吸附量先升后降，當濃度達到2 mg/mL 時，吸附量最大，之后吸附量出現(xiàn)了降低的趨勢，所以蕤核葉總黃酮的濃度在1 mg/mL～2 mg/mL 時吸附效果最佳。

圖3 上樣液濃度對吸附量的影響Fig.3 Effect of sample concentration on adsorption

2.3.3 上樣量的篩選

上樣液量與樹脂比對吸附量的影響見圖4。

圖4 上樣液量與樹脂比對吸附量的影響Fig.4 Effect of ratio sample solution to resin on adsorption

由圖4 顯示，在樹脂量一定的情況下，添加同一濃度不同量的上樣量，上樣量與樹脂的比為8 ∶1 時吸附量最大。上樣量少時，吸附量大，但純化周期長，上樣量多時，達到樹脂的飽和吸附量后，會造成部分黃酮的損失，樹脂吸附率降低。所以上樣量與樹脂的比例為8 ∶1 時吸附效果最佳。

2.3.4 洗脫劑濃度的篩選

洗脫劑濃度對解吸率的影響見圖5。

圖5 洗脫劑濃度對解吸率的影響Fig.5 Effect of eluent concentration on desorption rate

由圖5 可知，不同濃度的乙醇溶液洗脫的效果不同，乙醇濃度達到60%時洗脫率最高，繼續(xù)增加乙醇濃度，洗脫率的變化不大，考慮到溶劑成本，確定60%的乙醇溶液是最佳洗脫溶劑。

2.3.5 洗脫劑用量的篩選

洗脫劑用量影響見圖6。

圖6 洗脫劑用量的影響Fig.6 Effect of eluent solvent amount

在樹脂的洗脫過程中，洗脫劑的用量過少時，黃酮不能完全被洗脫，用量太多，對于后期的濃縮帶來不便，也會造成時間過長和試劑的浪費。由圖6，在收集的第3 份至第6 份洗脫液為清澈的黃色溶液，此時總黃酮濃度最大。隨著洗脫劑用量的增加，洗脫液顏色逐漸變淺，當收集到第8 份時洗脫液幾乎無色，經(jīng)檢測黃酮含量極少，即第8 份已被完全洗脫，以樹脂體積計，洗脫劑約為4 BV。

3 討論與結論

大孔吸附樹脂是由可聚合成分與添加劑經(jīng)懸浮或反懸浮聚合反應制備而成，具有大孔結構的高分子吸附分離材料。其吸附作用源于范德華力或氫鍵作用，吸附選擇性源于其中的功能基及其網(wǎng)狀結構的篩分性能[13]。因此樹脂的篩選至關重要。大孔吸附樹脂具有吸附容量大、吸附速度快、再生方便等優(yōu)點，已被廣泛應用于醫(yī)藥工業(yè)、化學工業(yè)、分析化學等領域[14]。

本文通過4 種樹脂對蕤核葉總黃酮吸附和解吸性能的分析，綜合考慮吸附率、解析率和靜態(tài)吸附動力學三方面因素，篩選出AB-8 型樹脂最適合于蕤核葉總黃酮的分離純化。接著對影響純化效果的工藝參數(shù)進行了研究，首次對上樣液濃度、上樣液用量、洗脫劑的濃度、洗脫劑的用量等因素的研究，得到AB-8 樹脂最佳純化工藝條件：提取液pH 為4，吸附時間4 h，上樣液的濃度為1 mg/mL～2 mg/mL，上樣量與樹脂之比8 ∶1；洗脫劑選用60%乙醇，用量4 BV。通過實驗結果分析，應用AB-8 型大孔樹脂純化的最佳工藝條件，蕤核葉總黃酮的純度由15.3%提高到48.6%。

本試驗在純化處理之前，對粗提液進行了石油醚脫脂等預處理，有效防止葉綠素及其雜質(zhì)造成樹脂的污染和堵塞，提高樹脂純化效果并降低成本。

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