韓蕾,趙國建,李雪姣,邰源臨,魏學智,*
(1.山西師范大學生命科學學院,山西臨汾041004;2.山西師范大學工程學院,山西臨汾041004 3.水利部水土保持植物開發(fā)管理中心,北京100083)
蕤核(Prinsepia uniflora Batal.)又名蕤李子(救荒本草),扁禾木(樹木分類學),茹茹(山西)等,屬薔薇科(Rosaceae) 李亞科(Prunnoideae focke) 扁核木屬(Prinsepia Royle)的落葉灌木。主要分布于河南、山西、陜西、內(nèi)蒙古等省區(qū),生長在900 m~1 100 m 山坡陽處或山腳下,是喜光、耐旱、耐寒的陽性樹種。果實風味獨特,酸甜適口,果仁可入藥,養(yǎng)肝明目,是一種具有經(jīng)濟價值野生植物資源[1]。黃酮類化合物(flavonoids)是高等植物體內(nèi)普遍存在的一大類重要的次生代謝產(chǎn)物,對人類的衰老、腫瘤、心血管等疾病的預防和治療具有重要意義[2-3]。
目前有關蕤核黃酮類物質(zhì)的研究報道甚少[4],對總黃酮分離純化的工藝條件未見報道,因此本試驗選取4 種大孔樹脂進行靜態(tài)吸附解吸及靜態(tài)動力學研究,篩選出最佳的樹脂類型并確定其最佳工藝條件,為蕤核葉總黃酮的分離純化奠定了理論基礎。
供試材料蕤核葉片,于2011年8月采自山西省臨汾市龍祠村。葉片除雜、洗凈、烘干,用粉碎機粉碎,過60 目篩置于塑封袋中備用。
RE-52A 型旋轉蒸發(fā)儀:上海青浦滬西儀器廠;SHB-Ⅱ型循環(huán)水式多用真空泵:鄭州長城科工貿(mào)有限公司;721 型可見分光光度計:上海天普分析儀器有限公司;101-3BS 型電熱鼓風干燥箱:金壇市榮華儀器有限公司。
1.3.1 樹脂的預處理
用無水乙醇浸泡24 h,使樹脂充分溶脂,以濕法裝柱,乙醇洗脫至流出液乙醇-水(1 ∶5)不成白色渾濁為止,然后用蒸餾水洗至無醇味,取出樹脂備用[5]。
1.3.2 蕤核葉總黃酮提取液制備和含量測定
取葉片粉末適量,按料液比1 ∶25,體積分數(shù)為60 %乙醇在70 ℃超聲波儀器中,輔助提取50 min 后抽濾,重復3 次,合并濾液濃縮,用石油醚反復萃取直到醚相基本無色,去除色素等脂溶性的雜質(zhì),水相用3 倍~4 倍量95 %乙醇沉淀去除多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)[6]。
測定含量參照梁曉華[7]的方法,以蘆丁為標準品,510 nm 處測吸光值,繪制標準曲線,得到回歸方程:A=0.011 3C+0.000 5(R2=0.999 8),式中:C 為總黃酮濃度,(mg/L);A 為吸光度。
1.3.3 靜態(tài)吸附與解析
準確稱取處理好的4 種樹脂1 g 置于100 mL 錐形瓶中,加入黃酮提取液45 mL,封口后,室溫下振蕩24 h,使其充分吸附后,吸取上層液按1.3.2 的方法測定黃酮濃度。將靜態(tài)吸附飽和后的4 種樹脂抽濾干,轉至另4 個干凈的100 mL 錐形瓶中,加入60%乙醇溶液45 mL,封口后,室溫下振蕩解吸24 h,同法測定解吸液中黃酮濃度。計算各大孔樹脂對蕤核葉片黃酮的靜態(tài)吸附量、解吸率[8]。
吸附量(mg/g)=(提取液濃度-吸附后剩余溶液濃度)×上樣液體積/樹脂質(zhì)量
解吸率=[解吸液濃度×洗脫液體積/(提取液濃度-吸附后剩余溶液濃度)×上樣液體積]×100%
1.3.4 靜態(tài)吸附動力學分析
準確稱取處理好的大孔樹脂1.00 g 于100 mL 錐形瓶中,加入45 mL 提取液后振蕩至吸附平衡,每隔1 h 取上層液測定吸光值,繪制吸附動力學曲線。
1.3.5 最適樹脂分離純化黃酮的工藝條件
1.3.5.1 提取液pH 的篩選
取2 g 預處理后的樹脂于100 mL 錐形瓶中,分別加入pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的提取液,吸附飽和后測定黃酮的濃度,計算不同pH 條件下樹脂的吸附量。
1.3.5.2 上樣液濃度的篩選
取2 g 預處理后的樹脂于100 mL 錐形瓶中,依次加入50 mL 不同濃度的提取液1、2、3、4、5 mg/mL,充分吸附后測定黃酮濃度。
1.3.5.3 上樣量的篩選
取2 g 預處理后的樹脂于100 mL 錐形瓶中,分別加入10、16、20、26、30 mL 的提取液,充分吸附后測定黃酮的濃度。
1.3.5.4 洗脫劑濃度的篩選
將經(jīng)過預處理的樹脂濕法裝柱,按照已確定的最佳條件上樣,充分吸附后,蒸餾水洗至無糖反應(Molish 反應),用濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液洗脫,洗脫流速為2 mL/min,測定黃酮的濃度。
1.3.5.5 洗脫劑用量的篩選[9]
按照最佳條件上樣、吸附和洗脫,洗脫速度為2 mL/min,每收集0.5 BV 體積測定其黃酮的濃度,共收集6 BV 體積,繪制洗脫曲線,確定洗脫劑的用量。
4 種樹脂的靜態(tài)吸附率和解析率,結果見表1。
表1 不同型號樹脂飽和吸附率和解析率Table 1 Adsorption capacity and desorption rate of different kinds of macroporous resins
大孔吸附樹脂的純化是利用特殊的吸附劑-大孔吸附樹脂的吸附性和分子篩相結合的原理,從提取液中有選擇地吸附住有效成分,去除雜質(zhì)[10-11]。不同的樹脂對于黃酮的純化效果不同,為了更大限度的回收有效成分黃酮,考察樹脂的吸附率和解析率尤為重要。由表1 可知,大孔樹脂AB-8 吸附率為76.96%,DM-130 吸附率為75.44%,兩種樹脂的吸附效果接近,從解析率來看,AB-8 的解析率明顯的高于另外3 種樹脂,達到81.93%。基于試驗結果和綜合考慮,初步確定AB-8 大孔樹脂是純化蕤核葉總黃酮的最佳樹脂。
對大孔樹脂進行吸附動力學研究,結果見圖1。
圖1 靜態(tài)動力學曲線Fig.1 Static adsorption curvc of total flavonoids
由圖1 可知,4 種樹脂在4 h 內(nèi)吸附速度較快,4 h~5 h 基本達到飽和,5 h 后黃酮濃度趨于平穩(wěn),其中大孔樹脂AB-8 對蕤核葉黃酮的吸附能力最強,結合上述樹脂的吸附率和解吸率,適合純化黃酮類物質(zhì)不僅有較好的吸附能力,而且有較好的解吸能力,同時節(jié)約時間,在工業(yè)化生產(chǎn)中能提高生產(chǎn)效率。所以選擇AB-8 型大孔樹脂作為純化蕤核葉總黃酮的樹脂。
2.3.1 提取液pH 的篩選
黃酮類化合物是多羥基酚類,成弱酸性,在弱酸或酸性條件下吸附效果較好[12]。提取液pH 的不同,樹脂對蕤核葉總黃酮的吸附效率也不同,結果見圖2。
圖2 提取液pH 對吸附量的影響Fig.2 Effect of pH value sample solution on adsorption
由圖2 可知,提取液的pH 為4 時吸附率最高,隨著pH 的增大,吸附率降低,所以確定提取液pH 為4時吸附效果最好。
2.3.2 上樣液濃度的篩選
上樣液濃度對吸附量的影響見圖3。
從圖3 上樣液濃度對吸附量的影響曲線中可以看出,隨著蕤核葉總黃酮提取液濃度的增加,樹脂的吸附量先升后降,當濃度達到2 mg/mL 時,吸附量最大,之后吸附量出現(xiàn)了降低的趨勢,所以蕤核葉總黃酮的濃度在1 mg/mL~2 mg/mL 時吸附效果最佳。
圖3 上樣液濃度對吸附量的影響Fig.3 Effect of sample concentration on adsorption
2.3.3 上樣量的篩選
上樣液量與樹脂比對吸附量的影響見圖4。
圖4 上樣液量與樹脂比對吸附量的影響Fig.4 Effect of ratio sample solution to resin on adsorption
由圖4 顯示,在樹脂量一定的情況下,添加同一濃度不同量的上樣量,上樣量與樹脂的比為8 ∶1 時吸附量最大。上樣量少時,吸附量大,但純化周期長,上樣量多時,達到樹脂的飽和吸附量后,會造成部分黃酮的損失,樹脂吸附率降低。所以上樣量與樹脂的比例為8 ∶1 時吸附效果最佳。
2.3.4 洗脫劑濃度的篩選
洗脫劑濃度對解吸率的影響見圖5。
圖5 洗脫劑濃度對解吸率的影響Fig.5 Effect of eluent concentration on desorption rate
由圖5 可知,不同濃度的乙醇溶液洗脫的效果不同,乙醇濃度達到60%時洗脫率最高,繼續(xù)增加乙醇濃度,洗脫率的變化不大,考慮到溶劑成本,確定60%的乙醇溶液是最佳洗脫溶劑。
2.3.5 洗脫劑用量的篩選
洗脫劑用量影響見圖6。
圖6 洗脫劑用量的影響Fig.6 Effect of eluent solvent amount
在樹脂的洗脫過程中,洗脫劑的用量過少時,黃酮不能完全被洗脫,用量太多,對于后期的濃縮帶來不便,也會造成時間過長和試劑的浪費。由圖6,在收集的第3 份至第6 份洗脫液為清澈的黃色溶液,此時總黃酮濃度最大。隨著洗脫劑用量的增加,洗脫液顏色逐漸變淺,當收集到第8 份時洗脫液幾乎無色,經(jīng)檢測黃酮含量極少,即第8 份已被完全洗脫,以樹脂體積計,洗脫劑約為4 BV。
大孔吸附樹脂是由可聚合成分與添加劑經(jīng)懸浮或反懸浮聚合反應制備而成,具有大孔結構的高分子吸附分離材料。其吸附作用源于范德華力或氫鍵作用,吸附選擇性源于其中的功能基及其網(wǎng)狀結構的篩分性能[13]。因此樹脂的篩選至關重要。大孔吸附樹脂具有吸附容量大、吸附速度快、再生方便等優(yōu)點,已被廣泛應用于醫(yī)藥工業(yè)、化學工業(yè)、分析化學等領域[14]。
本文通過4 種樹脂對蕤核葉總黃酮吸附和解吸性能的分析,綜合考慮吸附率、解析率和靜態(tài)吸附動力學三方面因素,篩選出AB-8 型樹脂最適合于蕤核葉總黃酮的分離純化。接著對影響純化效果的工藝參數(shù)進行了研究,首次對上樣液濃度、上樣液用量、洗脫劑的濃度、洗脫劑的用量等因素的研究,得到AB-8 樹脂最佳純化工藝條件:提取液pH 為4,吸附時間4 h,上樣液的濃度為1 mg/mL~2 mg/mL,上樣量與樹脂之比8 ∶1;洗脫劑選用60%乙醇,用量4 BV。通過實驗結果分析,應用AB-8 型大孔樹脂純化的最佳工藝條件,蕤核葉總黃酮的純度由15.3%提高到48.6%。
本試驗在純化處理之前,對粗提液進行了石油醚脫脂等預處理,有效防止葉綠素及其雜質(zhì)造成樹脂的污染和堵塞,提高樹脂純化效果并降低成本。
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