許美玲，張鑫，楊娟，陳偉，杜震，董麗君，張麗，周洪娟，郝建光

（臨沂出入境檢驗檢疫局，山東臨沂276034）

罐頭是我國具有傳統(tǒng)特色的產(chǎn)業(yè)，是我國主要的加工食品，在出口食品中占有重要地位。其中，水果罐頭是國內(nèi)外罐頭食品市場頗受歡迎的產(chǎn)品，約占罐頭總產(chǎn)量的25%，具有較大的發(fā)展前景[1-2]。糖水水果罐頭雖然經(jīng)過殺菌處理，但有時在罐頭食品中仍然可能有微生物存在，導致水果罐頭中果肉發(fā)生腐敗變質。對由于不同罐頭制品營養(yǎng)環(huán)境各不相同，其污染菌也不盡相同，在實際檢測中常常采取不同性質的培養(yǎng)基利于檢出特定的污染菌[3]。為防止水果罐頭腐敗變質，延長貨架期，保護我國消費者健康安全及出口食品安全，本文旨在對糖水水果罐頭中的污染微生物進行分析，探索糖水水果罐頭中微生物檢測方法，降低微生物污染率。同時，也為罐頭食品微生物檢測提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品來源

草莓罐頭、黃桃罐頭：來源于工廠發(fā)生腐敗變質的罐頭，罐內(nèi)果肉組織解體。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基（FT）、錳鹽營養(yǎng)瓊脂、酸性肉湯、溴甲酚紫葡萄糖肉湯、皰肉培養(yǎng)基基礎、麥芽浸膏湯均購自北京陸橋技術有限責任公司。

2）嗜熱耐酸芽孢桿菌培養(yǎng)基：酵母浸膏5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，磷酸氫二鉀4 g，瓊脂粉18 g，水1 000 mL，121 ℃，15 min 高壓滅菌。

3）AC 瓊脂：酵母浸膏3g，蛋白胨20g，牛肉膏3g，麥芽浸膏3 g，葡萄糖5 g，VC0.2 g，瓊脂粉18 g，水1 000 mL，121 ℃，15 min 高壓滅菌。

4）硫乙醇鈉瓊脂培養(yǎng)基：按每100 mL 硫乙醇胺肉湯加入1.5%～2.0%瓊脂粉，121℃，15 min 高壓滅菌。

1.1.3 試劑

細菌瓊脂粉、葡萄糖、胰酪蛋白胨、麥芽浸粉、牛肉浸粉、酵母浸膏、牛肉膏、蛋白胨均購自北京陸橋生物技術有限公司；磷酸氫二鉀、氯化錳均為分析純；BD生化鑒定板條購自美國BD 生物技術有限公司。

1.1.4 儀器

MOS-3020 SNAYO 高壓滅菌鍋、MIR-253 生化培養(yǎng)箱：日本三洋電子有限公司；BUG BOX M 厭氧微生物培養(yǎng)工作站：英國RUSKINN 公司；CLASSⅡTYPE A2 生物安全柜：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；PHOENIX 100 微生物鑒定儀：美國BD 設備有限公司；BX41 OLYMPUS 生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方式

采用35、55 ℃兩種溫度；有氧與厭氧環(huán)境。

1.2.2 密封性檢驗

將罐頭制品放入水中，觀察有無氣泡產(chǎn)生[4]。

1.2.3 內(nèi)容物增菌

將待測樣品放置在超凈工作臺上，開啟紫外燈30 min后，用75%酒精進行表面消毒。用滅菌開罐器開啟罐頂，如系胖聽罐頭可用注射器吸取少許罐頭內(nèi)氣體用以鑒定氣體種類。無菌取出罐頭樣品至均質袋內(nèi)均質，分別取1 mL 內(nèi)容物轉入皰肉肉湯、溴甲酚紫葡萄糖肉湯、麥芽浸膏肉湯、硫乙醇酸鈉肉湯、酸性肉湯增菌培養(yǎng)基中，分別在35、55 ℃兩種溫度下連續(xù)培養(yǎng)96 h，每24 小時觀察記錄一次。

1.2.4 分離培養(yǎng)

分別選用皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鈉瓊脂培養(yǎng)基、嗜熱耐酸芽孢桿菌培養(yǎng)基、AC 瓊脂培養(yǎng)基、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)120 h，每24 小時觀察記錄試驗現(xiàn)象。

1.2.5 純培養(yǎng)

將各培養(yǎng)基中培養(yǎng)物挑取單菌落分別接種到與其相對應的培養(yǎng)基中，進行純培養(yǎng)。

1.2.6 厭氧培養(yǎng)和高溫驗證試驗

將有氧分離的純培養(yǎng)物接種到皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鈉瓊脂培養(yǎng)基、嗜熱耐酸芽孢桿菌培養(yǎng)基、AC 瓊脂培養(yǎng)基、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基，分別置于厭氧微生物工作站中，在35、55 ℃以及有氧環(huán)境55 ℃條件下培養(yǎng)。55 ℃條件下培養(yǎng)的培養(yǎng)基在培養(yǎng)96 h 后放入35 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察并記錄實驗現(xiàn)象。

1.2.7 鑒定方法

采取革蘭氏染色、芽孢染色[5]等染色方法相結合的方式對試驗中的微生物進行鑒定，根據(jù)其生長特征、生理特征、外觀形態(tài)并結合細菌鑒定手冊[6]、伯杰細菌鑒定手冊[7]進行進一步判斷，最后利用微生物鑒定儀進行菌種綜合鑒定。

2 結果與討論

2.1 罐頭密封性檢測結果

實驗所用罐頭密封性良好，放入水中并未產(chǎn)生氣泡。草莓罐頭內(nèi)容物的pH 經(jīng)測定為2.88，黃桃罐頭內(nèi)容物的pH 為3.46，同批次正常草莓罐頭和黃桃罐頭的pH 范圍分別為3.4～3.6 和3.6～4.0，草莓罐頭發(fā)生了酸化，pH 降低，而黃桃罐頭pH 在正常范圍內(nèi)。因pH小于4.6，屬于酸性罐頭。本次實驗所選用的兩種糖水水果罐頭均未發(fā)現(xiàn)胖聽現(xiàn)象。

2.2 罐頭中腐敗微生物增菌結果及分析

不同增菌液的增菌效果見表1。

表1 黃桃罐頭、草莓罐頭中腐敗微生物增菌實驗結果Table 1 Choice of optical medium for enriching spoilage bacteria isolated from canned peach and canned strawberry in various media respectively

由表1 可以看出，在培養(yǎng)24h 內(nèi)未發(fā)現(xiàn)菌落生長現(xiàn)象，培養(yǎng)48 h 后培養(yǎng)基出現(xiàn)不同程度的渾濁現(xiàn)象，溴甲酚紫葡萄糖肉湯紫色褪去，皰肉肉湯中出現(xiàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象。黃桃罐頭在35 ℃條件下，在硫乙醇酸鈉肉湯中培養(yǎng)效果最好，在溴甲酚紫葡萄糖肉湯中未見生長，在55 ℃培養(yǎng)條件下，未見生長。草莓罐頭在35 ℃條件下，在酸性肉湯、麥芽浸膏肉湯中培養(yǎng)效果最好，在55 ℃條件下，在溴甲酚紫葡萄糖肉湯、麥芽浸膏肉湯中培養(yǎng)效果最好，在兩種溫度下，酸性肉湯中未見生長。

2.3 罐頭中腐敗微生物分離、純化與培養(yǎng)

2.3.1 罐頭中腐敗微生物分離培養(yǎng)結果與分析

腐敗微生物分培養(yǎng)結果見表2。

在進行分離培養(yǎng)時，黃桃罐頭在皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和硫乙醇酸鈉瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)效果最好，草莓罐頭在皰肉瓊脂培養(yǎng)基、AC 瓊脂培養(yǎng)基和嗜熱耐酸芽孢桿菌培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)效果最好。所有培養(yǎng)基在24 h 內(nèi)均為發(fā)現(xiàn)菌落生長，培養(yǎng)48 h 后培養(yǎng)效果漸佳。

2.3.2 罐頭中腐敗微生物純培養(yǎng)結果與分析

罐頭中腐敗微生物純培養(yǎng)結果見表3。

表2 罐頭中腐敗微生物培養(yǎng)基分離篩選結果Table 2 Growth status of spoilage bacteria isolated from canned peach and canned strawberry in various media respectively

表3 罐頭中腐敗微生物純培養(yǎng)結果Table 3 Growth status of pure culture of spoilage bacteria isolated from canned peach and canned strawberry in various media respectively

在皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鈉瓊脂培養(yǎng)基上，分離得到的單菌落生長狀況最佳，在24 h 時即可達到較好的生長狀態(tài)。而其他幾種培養(yǎng)基也有生長，但生長緩慢。由此可以看出，皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鈉瓊脂培養(yǎng)基是較好的純化培養(yǎng)基，其他培養(yǎng)基生長效果較差。

2.3.3 罐頭中腐敗微生物厭氧培養(yǎng)結果與分析

通過對純化的4 株菌株進行厭氧培養(yǎng)，48 h 時觀察結果發(fā)現(xiàn)，A 菌株在厭氧條件下不生長，B、C、D 菌株在厭氧條件下生長良好。

2.4 罐頭中腐敗微生物的鑒定

2.4.1 菌落形態(tài)特征和鏡檢結果

分離的腐敗微生物菌落形態(tài)及革蘭氏染色鏡檢結果見表4。

2.4.2 微生物鑒定儀鑒定結果

根據(jù)對分離純化菌株革蘭氏染色結果，選擇BD細菌的快速鑒定板條，系統(tǒng)給出的鑒定結果見表5。

表4 罐頭中污染菌形態(tài)觀察Table 4 Cell morphology of bacterium in canned peach and canned strawberry

表5 分離到的微生物鑒定結果Table 5 The identification results of the isolated micro-organism

3 結論

1）罐頭食品中的微生物受食品中的pH 的影響

罐頭食品按pH 的不同可分為低酸性食品和酸性食品，pH≥4.6 為低酸性食品，pH≤4.6 為酸性食品。糖水水果罐頭pH 在2.5～3.5 之間，故糖水水果罐頭為酸性食品。酸性罐頭食品能生長繁殖的耐酸的微生物無論在數(shù)量上還是在種類上都遠比低酸性罐頭食品少。微生物生長環(huán)境不同，分離得到的污染菌也不盡相同。因此，選擇合適的增菌肉湯及分離培養(yǎng)基尤其重要。通過糖水水果罐頭在不同增菌培養(yǎng)基及分離培養(yǎng)基分離結果，可以看出：黃桃罐頭硫乙醇酸鈉肉湯中增菌效果最好，在皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和硫乙醇酸鈉瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)效果最好，這與史振霞等的研究結果類似[8]；草莓罐頭在酸性肉湯、麥芽浸膏肉湯中增菌效果最佳，在皰肉瓊脂培養(yǎng)基、AC 瓊脂培養(yǎng)基和嗜熱耐酸芽孢桿菌培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)效果最好。

2）通過生化實驗，結合細菌鑒定手冊、伯杰細菌鑒定手冊和BD 微生物鑒定儀，發(fā)現(xiàn)黃桃罐頭、草莓罐頭腐敗過程中滋生的主要微生物為：A 菌為成團泛菌（Pan.agglomerans）；B 和C 菌株為同一種菌，為地衣芽孢桿菌（Baci. licheniformis）；D 菌為蠟樣芽孢桿菌（Baci.cereus）。

[1] 任國平,張倩,范麗平,等.水果罐頭加工中生物危害的分析和控制[J].食品研究與開發(fā),2011,32(9):210-212

[2] 杜紅利,劉暢.罐頭制品中微生物檢測方法[J].肉類工業(yè),2008,11:40-42

[3] 閆訓友,杜洪利,張艷麗,等.山楂罐頭中腐敗微生物的分離鑒定及其特性的研究[J].食品工業(yè)科技,2010,31(5):191-194

[4] 馬長利,張志新,郝子成.熱解糖梭菌致蘑菇罐頭膨脹變質的實驗分析[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2005(5):433-435

[5] 羅雪云,劉宏道.食品衛(wèi)生微生物檢測標準手冊[M].北京:中國標準出版社,1995:400-438

[6] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001

[7] R E 布坎南,N E 吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊[M].8 版.北京:科學出版社,1984

[8] 史振霞,杜洪利,歐旭,等.桃罐頭中腐敗微生物的分離純化及鑒定研究[J].食品科學,2009,30(21):278-282