鐘響，劉寧，尹偉力，耿金培，粟智平，段效輝

（煙臺出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 煙臺 264000）

食品安全問題中最常見卻最易被忽視的原因就是食物被致病性細(xì)菌污染。根據(jù)《衛(wèi)生部關(guān)于2012年全國食物中毒事件情況的通報》[1]，微生物性食物中毒事件的報告起數(shù)和中毒人數(shù)均為最多。沙門氏菌是最重要的食源性致病菌中之一，屬于腸桿菌科，是肉及肉制品、蔬菜甚至水產(chǎn)品感染的重要來源。我國沙門氏菌的檢驗(yàn)方法多采用傳統(tǒng)方法，操作繁瑣，耗時較長，很難適應(yīng)食品安全和公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處理快速反應(yīng)的需要；同時，由于沙門氏菌屬有2000種以上的血清型，生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)多有交叉，因此傳統(tǒng)檢測方法在特異性和敏感性上也有其局限性[2-3]。

NASBA （nucleic acid sequence-based amplification）技術(shù)，即依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)，是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種擴(kuò)增RNA的新型分子生物學(xué)檢測技術(shù)。NASBA技術(shù)操作簡便，不需要特殊儀器；不需要溫度循環(huán)，42℃2 h左右可將模板擴(kuò)增109～1012倍，靈敏度高；由于外源雙鏈DNA無T7啟動子序列，不會被擴(kuò)增，大大提高了NASBA反應(yīng)的特異性[4-5]。NASBA已成功應(yīng)用于禽流感、麻疹病毒、帶狀皰疹病毒、輪狀病毒、丙肝病毒、口蹄疫病毒、草莓斑駁病毒等多種病毒檢測[6-13]，但在DNA病原菌檢測中的研究甚少。本研究將NASBA技術(shù)用于食品中沙門氏菌的檢測，可縮短檢測周期，提高檢出率，為進(jìn)出口和國內(nèi)食品安全提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium ATCC 14028，甲型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphi A ATCC9150，大腸埃希氏菌Escherichia coli ATCC25922，金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus ATCC25923，均來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑

細(xì)菌總RNA提取試劑盒：商品名E.Z.N.ATM，美國Omega公司；T7RNA聚合酶（20 U/μL）、RNAseH（5U/μL）、AMV（20 U/μL）、NTP（4×25μmol×100 mM）、dNTP（4×10 mM each）、RNA Laddder、引物（上海生工），RNasin（40 U/μL）、6×RNA Loading buffer、50×TAE、EB：北京鼎國培養(yǎng)基等：北京陸橋。

1.1.3 主要儀器

PTC-200型PCR基因擴(kuò)增儀：美國MJ公司；BioPhotometer核酸蛋白分析儀：德國eppendorf；多用電泳系統(tǒng)PROTEAN II：美國BIO-RAD；凝膠成像系統(tǒng)Alpha Imager2200：美國 Alpha Innotech。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)沙門氏菌屬invA基因保守序列設(shè)計(jì)引物，序列如下（畫線部分為T7 RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)）：

SM-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAG CTGCGGTATTCGTGACTT-3’

SM-R：5’-GTGGTGGTCGCAGTTG-3’

1.2.2 總RNA的提取

按照細(xì)菌總RNA提取試劑盒E.Z.N.ATM說明提取細(xì)菌總RNA，測定OD值，評價RNA質(zhì)量。

1.2.3 NASBA擴(kuò)增

1）在25μL擴(kuò)增體系中加入 AMV反轉(zhuǎn)錄酶Buffer（5×）5μL，T7 RNA 聚合酶 Buffer（5×）5μL，RNaseH Buffer（10×）2.5μL，RNasin（RNA 酶抑制劑，40 U/μL）0.5μL ，上、下游引物（15μmol/L）各 1μL，RNA 模板 2μL；置于 65℃、5 min，使 RNA 解鏈；然后立即置于42℃、5 min。

2）迅速加入 T7 RNase（20 U/μL）2μL，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶（20 U/μL）0.4μL ，RNaseH（5 U/μL）0.05μL，無菌ddH2O補(bǔ)至25μL；小心混勻并輕微離心，置于42℃中孵育90 min；反應(yīng)完成后立即將反應(yīng)管置于-20℃終止反應(yīng)，備用。

1.2.4 電泳及結(jié)果記錄

將冷卻的NASBA產(chǎn)物點(diǎn)樣于2.0 g/L瓊脂糖凝膠，置于1×TAE緩沖液中，5 V/cm電壓電泳20 min，EB染色10 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5 特異性試驗(yàn)

取鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028，甲型副傷寒沙門氏菌ATCC9150，大腸埃希氏菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923，按1.2.3和1.2.4進(jìn)行特異性反應(yīng)。

1.2.6 靈敏度試驗(yàn)

將提取的細(xì)菌總RNA稀釋成同樣濃度40ng/μL，用 DEPC 處理滅菌水稀釋為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-55個梯度，分別進(jìn)行NASBA擴(kuò)增，試驗(yàn)步驟同1.2.3和1.2.4。

1.2.7 人工污染樣品驗(yàn)證試驗(yàn)

1.2.7.1 人工污染樣品

按表1所示人工污染9份樣品。

表1 人工污染樣品情況Table 1 Artificially contaminated samples

1.2.7.2 樣品的增菌

各取樣品25 g，加入225 mL緩沖蛋白胨水，36℃培養(yǎng)18 h～24 h。

1.2.7.3 NASBA擴(kuò)增及菌種鑒定

將上述增菌液提取總RNA，進(jìn)行NASBA擴(kuò)增，電泳觀察結(jié)果。同時按照GB 4789.4-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行沙門氏菌鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗(yàn)

以鼠傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌總RNA及無菌水（CK）作為模板，加入引物SM-F/SM-R，進(jìn)行NASBA試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，該對引物只有在模板為沙門氏菌屬的擴(kuò)增反應(yīng)中出現(xiàn)明亮的條帶，大小約為277 bp，并且兩種沙門氏菌均能夠擴(kuò)增，而其余3種RNA未出現(xiàn)擴(kuò)增信號，結(jié)果與預(yù)期相符，表明引物SM-F/SM-R的特異性較強(qiáng)。

2.2 靈敏度試驗(yàn)

圖1 沙門氏菌特異性試驗(yàn)NASBA擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The specificity test of Salmonella

從鼠傷寒沙門氏菌中提取的總RNA濃度為54.6ng/μL，稀釋后濃度為：5.5ng/μL、550 pg/μL、55 pg/μL、5.5 pg/μL、550 fg/μL。分別用這些 RNA 作模板、SM-F/SM-R作引物進(jìn)行NASBA擴(kuò)增，結(jié)果表明（圖2），當(dāng)RNA稀釋至10-5（即550 fg/μL）時，檢測不到信號，因此該方法檢測的靈敏度可達(dá)10-4，即5.5 pg/μL總RNA。

圖2 鼠傷寒沙門氏菌靈敏度試驗(yàn)NASBA擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The sensitivity test of Salmonella

2.3 人工污染樣品的檢測

以增菌后的9份人工污染樣品RNA、陽性質(zhì)控鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株RNA和陰性質(zhì)控?zé)o菌水作為模板，SM-F/SM-R作為引物進(jìn)行NASBA檢測沙門氏菌的驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，陽性質(zhì)控出現(xiàn)約277 bp的明亮條帶，陰性質(zhì)控?zé)o條帶，添加鼠傷寒沙門氏菌的4號、6～10號樣品和添加甲型副傷寒沙門氏菌的1、5、7、8號樣品均出現(xiàn)明亮的特異性條帶，大小約為277 bp，其余2種樣品RNA未出現(xiàn)擴(kuò)增信號，結(jié)果與樣品實(shí)際添加情況相符。

圖3 沙門氏菌人工污染樣品NASBA擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Results for detecting Salmonella in artificially contaminated samples by NASBA

3 結(jié)論與討論

本研究建立了食品中沙門氏菌的NASBA檢測方法，進(jìn)行了方法的特異性和靈敏度試驗(yàn)，同時驗(yàn)證了對樣品檢測的實(shí)際應(yīng)用效果。結(jié)果表明：應(yīng)用NASBA技術(shù)檢測沙門氏菌特異性強(qiáng)，能夠從背景復(fù)雜的樣品中檢測出目標(biāo)菌，試驗(yàn)中無假陽性和假陰性結(jié)果；靈敏度高，對目標(biāo)菌的檢出限達(dá)到10-4，即pg/μL級總RNA；檢測周期短，除增菌步驟外，只需要3 h～4 h即可得到結(jié)果，完成樣品中目標(biāo)菌的篩選。

需要注意的是，食品一般要經(jīng)過加工、深加工、冷凍/冷藏、包裝等步驟，在此過程中微生物很可能受到損傷，因此有必要先復(fù)蘇樣品中的受損菌，如果不經(jīng)過增菌直接進(jìn)行NASBA檢測，則極有可能造成漏檢。本研究建立的方法可大大縮短檢測時間，雖然為保證樣品的檢出率和準(zhǔn)確性，需要進(jìn)行增菌復(fù)蘇，但仍可將接收樣品至出具報告整個流程縮短至最短24 h。NASBA檢測的陽性結(jié)果仍需經(jīng)生化確認(rèn)。

另外，本研究為了更適用于基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)和現(xiàn)場快速檢測，對于NASBA產(chǎn)物采用了最直觀、最簡便的瓊脂糖凝膠電泳檢測方法，但這種方法只能對目標(biāo)菌定性。如果需要進(jìn)行定量研究，應(yīng)考慮基于電化學(xué)發(fā)光原理的NASBA-ECL檢測法、分子信標(biāo)與NASBA結(jié)合的AmpliDet RNA技術(shù)以及原位NASBA（IS-NASBA）技術(shù)[14]。

[1]衛(wèi)生部辦公廳.衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于2012年全國食物中毒事件情況的通報[EB/OL].中華人民共和國國家衛(wèi)生和 計(jì)劃生育委員會官方網(wǎng)站,(http：//www.moh.gov.cn/mohwsyjbgs/s7860/201303/b70872682e614e4189d0631ae5527625.shtml),2013-02-26

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