李龍飛，金瑩，趙曉磊，何金興，*

（1.齊魯工業(yè)大學食品與生物工程學院，山東濟南250353；2.黃島出入境檢驗檢疫局，山東青島266555）

雌激素是一類具有相似化學結構，可直接影響動物代謝與繁殖的類固醇激素[1]。己烷雌酚（HEX）、己烯雌酚（DES）和雙烯雌酚（DE）是人工合成的雌激素，主要應用于畜牧業(yè)生產(chǎn)[2]，對動物的生長催肥具有顯著作用。但雌激素可對人和動物的內分泌系統(tǒng)產(chǎn)生強烈干擾，并具有潛在的致癌性[3-5]。鑒于此美國、歐盟等多國已明文規(guī)定對其禁用或限用，我國也在2002年明確規(guī)定對其禁用[6]。飲水是雌激素進入生物體的重要途徑之一，我國水污染現(xiàn)狀嚴重，已有證據(jù)表明部分地區(qū)日常飲水中存在雌激素[7]，雖然濃度很低，但由于雌激素類物質即使在極低濃度下也會對生物體產(chǎn)生很大的影響[8]，所以為保障飲用水安全，對其進行相應檢測十分必要。

目前，測定環(huán)境中雌激素殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[9]、液相色譜法[10]、免疫酶分析法[11]、毛細管電色譜法[12]、電化學分析法[13]、氣相色譜-質譜聯(lián)用[14]及液相色譜-質譜聯(lián)用[15]等。然而，上述方法一般需要使用昂貴的儀器設備或進行繁瑣的樣品衍生化等前處理步驟，才能檢測環(huán)境中低濃度殘留的雌激素，不適于日常樣品的檢測。與普通吸附材料多為物理吸附不同，本研究以溶膠凝膠技術合成的聚合物為固相萃取材料[16]，利用其具有選擇性吸附的特點，結合高效液相色譜進行分析，建立了固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用檢測飲用水中3 種雌激素殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-20AT 高效液相色譜儀，SPD-M20A 二極管陣列檢測器：日本島津公司；梅特勒AL104 電子天平：中國梅特勒-托利多公司；Supelco 固相萃取裝置：美國Supelco 公司；JB-2A 恒溫磁力攪拌器：上海雷磁創(chuàng)意儀器儀表有限責任公司。

己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚：色譜純，sigma 公司；乙腈、甲醇：色譜純，天津化學試劑廠；二次去離子水（DDW，18 MΩ cm-1，Milli-Q 超純水器制得）；四乙氧基硅烷（分析純，tetraethoxysilane，TEOS）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（分析純，3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）、醋酸、磷酸：分析純，武漢大學化工廠。

標準儲備溶液：準確稱取DES、DS、HEX 各2 mg，分別置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，于4 ℃條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

混合標準儲備溶液：準確稱取3 種雌激素標準品各5 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，配置成500 mg/L 的混合標準液，同樣于4 ℃條件下儲存。工作溶液則按需要用甲醇逐級稀釋。

礦泉水：于山東濟南長清地區(qū)超市購得；自來水：于山東濟南長清地區(qū)采得。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的選擇

色譜柱Xterra C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters，USA），流動相為20 mmol/L H3PO4/甲醇，流速為1.0 mL/min，柱溫為38 ℃，進樣量為20 μL，檢測波長為230 nm。采用色譜峰的保留時間定性，外標法峰面積定量。

1.2.2 標準曲線的繪制

將3 種樣品混合標準液分別稀釋成質量濃度為10、8、5、2、1、0.5 μg/mL 的標準系列，依次進樣分析，然后根據(jù)峰面積與質量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.2.3 固相萃取柱的制備

在50 mL 具塞的圓底燒瓶中加入5 mL 乙腈，1 mL APTES，磁力攪拌30 min 后加入2 mL TEOS，繼續(xù)攪拌反應20 min，然后加入1 mL 0.01 mol/L 的醋酸，磁力攪拌10 min，置于水浴鍋中60 ℃孵化10 h，過濾，用甲醇洗滌，于真空干燥箱中100 ℃下老化10 h。將所得材料研磨成小顆粒，稱取200 mg，作為預富集柱的填料，使用前依次用3 mL 純水，3 mL 甲醇和3 mL 純水進行活化處理。

1.2.4 樣品制備

試驗選用礦泉水和自來水作為樣品，經(jīng)0.45 μm 水系濾膜過濾，于4 ℃條件下保存。使用時先用0.1 mol/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調整pH，然后經(jīng)固相萃取柱富集，富集體積100 mL，用適當?shù)南疵撘合疵?，將洗脫液用氮氣吹干，并? mL 甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm 有機系濾膜過濾，注入HPLC 檢測分析。

制備加標樣品。取適量的混合標準儲備液，加入礦泉水與自來水樣品中，分別配制成質量濃度為50、100、150 μg/L 的混合標準樣品工作液，檢測過程與上述樣品相同。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

以20 mmol/L H3PO4/甲醇作為流動相，研究不同比例對3 種雌激素分離效果的影響。

圖1 3 種雌激素混合色譜圖Fig.1 Chromatograph of estrogen mixed standard solution

從圖1 可以看出，20 mmol/L H3PO4/甲醇比例為36 ∶64（體積比）時，3 種雌激素在17 min 內可以達到完全的基線分離，且各色譜峰具有良好的對稱性。根據(jù)單標色譜圖的結果可知圖1 中依次出現(xiàn)的3 種雌激素分別是DES、DS、HEX。

2.2 固相萃取條件的選擇

將200 mg 合成聚合物裝填在預富集柱中，富集水溶液中的雌激素殘留，為達到最佳的萃取效果，分別對洗脫溶劑、樣品溶液pH、富集流速和洗脫流速等條件進行優(yōu)化。

2.2.1 洗脫溶劑的選擇

選擇濃度為100 μg/L 的混合樣品溶液進行上樣，富集體積為100 mL，富集流速為1 mL/min，洗脫流速為1 mL/min，然后分別用3 mL 甲醇、乙腈進行洗脫，按1.2.4 方法處理后進行HPLC 分析，記錄出峰面積。不同的洗脫溶劑對三種雌激素的洗脫效果如圖2 所示。

圖2 不同洗脫劑對3 種雌激素洗脫效果圖Fig.2 Effect of different elution on extraction efficiency

從圖2 中可以看出當以甲醇、乙腈作為洗脫劑時，乙腈對三種雌激素的洗脫效果除己烷雌酚外，其余兩種雌激素的峰面積均較低，同時可以看出甲醇的洗脫效果整體明顯優(yōu)于乙腈，所以最終選擇甲醇作為洗脫劑。

2.2.2 pH 對萃取效果的影響

分別配制濃度為100 μg/L，pH 為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的雌激素水溶液100 mL，控制流速為1 mL/min進行富集，然后用3 mL 甲醇洗脫，洗脫流速為1 mL/min，按1.2.4 方法處理后進行HPLC 分析，記錄出峰面積，結果見圖3。

圖3 不同pH 對雌激素富集效果的影響曲線Fig.3 Effect of pH on extraction efficiency

由圖3 可見，pH 在4.0～8.0 范圍內，3 種雌激素的峰面積變化不大。DS，HEX 在pH 低于6.0 時，峰面積均隨pH 的增加而增大，當pH 超過6.0 時，峰面積略有下降；而DES 在pH 超過7.0 時開始下降，但鑒于DES 在pH 6.0 與pH7.0 時的峰面積相差不大，最終選擇基質pH 為6.0 用于后續(xù)的試驗。

2.2.3 富集流速對萃取效果的影響

用100 μg/L 的雌激素水溶液上樣100 mL，以考察富集流速對3 種雌激素吸附效果的影響。從圖4 可以看出，富集流速在0.5 mL/min 到2.0 mL/min 范圍內，3種雌激素的色譜峰面積一直呈下降趨勢，但過慢的富集流速勢必會影響到整個富集分析過程的效率，綜合考慮，最終選擇1 mL/min 作為適當?shù)母患魉佟?/p>

圖4 富集流速對雌激素富集效果的影響曲線Fig.4 Effect of enrichment flow rate on extraction efficiency

2.2.4 洗脫流速對萃取效果的影響

與富集流速相同，洗脫流速也是影響分析效率的重要參數(shù)，以1.0 mL/min 的流速上樣吸附后用甲醇洗脫，洗脫流速分別控制為0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min，測定結果如圖5 所示。

圖5 洗脫流速對雌激素分離效果的影響曲線Fig.5 Effect of elution flow rate on the desorption of estrogen

可以看出，洗脫流速在0.5 mL/min 和1.0 mL/min時對3 種雌激素的解吸效果相差不大，進一步提高洗脫流速則解吸效果開始明顯下降，可能的原因是過快的洗脫流速致使洗脫液無法與被萃取物充分作用，考慮到純化效率，洗脫流速最終選定為1.0 mL/min。

2.3 標準曲線、線性范圍和檢測限

以雌激素質量濃度X（μg/mL）與相應的目標組分的峰面積Y（S）做標準曲線，3 種雌激素對應的線性方程及相關系數(shù)如表1 所示。

表1 3 種雌激素的標準曲線回歸方程與相關系數(shù)（R2）Table 1 Standard curve and relevant coefficient of three estrogens

從表1 中可以看出，各標準曲線相關系數(shù)R2均大于0.99，說明3 種雌激素的線性關系良好。

逐步選擇較低及較高濃度的混合標準儲備液進樣分析，測得峰面積，通過標準曲線求出線性范圍。由此測得DES 的線性范圍是0.05 mg/L～500 mg/L，DS 的線性范圍是0.05 mg/L～500 mg/L，HEX 的線性范圍是0.1 mg/L～500 mg/L；根據(jù)3 倍噪音的峰面積響應值求出最低檢出限（LOD），其DES、DS、HEX 的最低檢出限分別為0.10，0.18 和0.29 μg/L。

2.4 加標回收率及重復性

用礦泉水與自來水分別配制3 個濃度水平的雌激素混合標準工作液，其中每個濃度水平重復測定5次，測定結果的相對標準偏差為3.5%～7.8%（n=5），其結果見表2，表3。

表2 礦泉水中雌激素加標的重復性測定情況Table 2 The extraction peak areas and RSD of estrogen in mineral sample

表3 自來水中雌激素加標的重復性測定Table 3 The extraction peak areas and RSD of estrogen in tapwater sample

由此可知，該方法具有較好的重現(xiàn)性。經(jīng)HPLC分析，根據(jù)回歸方程計算樣品加標回收率（見表4）。

由表4 可以看出，3 種雌激素的加標回收率為70.4%～80.1%，可滿足水樣中雌激素殘留的痕量檢測需要。相對標準偏差計算公式如下：

表4 不同樣品添加濃度對應雌激素的回收率Table 4 The recoveries of estrogen on three different spiked concentrations

2.5 實際樣品的測定

在優(yōu)化的條件下，對市售礦泉水及自來水樣品進行檢測，其中己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚均未檢出。樣品色譜及其加標色譜如圖6、圖7 所示。

圖6 礦泉水樣品色譜圖Fig.6 Chromatograph of a blank mineral sample and mineral sample spiked with 50 μg/L

圖7 自來水樣品色譜圖Fig.7 Chromatograph of a blank tap-water sample and tap-water sample spiked with 50 μg/L

3 結論

普通固相萃取材料的吸附性質多為物理吸附，雖具有一定的富集與凈化效果，但相對選擇性較差。本研究以溶膠凝膠技術合成的聚合物為固相萃取填充材料，其功能單體與雌激素間被認為可通過氫鍵相互作用，從而以非共價鍵連接，具有選擇性吸附的特點。該法前處理操作簡便快捷，結合高效液相色譜，建立了同時測定日常飲水中3 種雌激素殘留的檢測方法。在優(yōu)化的條件下，3 種雌激素的最低檢測限為0.1 μg/L～0.29 μg/L，加標回收率為70.4 %～80.1 %，且RSD 為3.5%～7.8%，可滿足定量分析的需要，方法簡便、靈敏、準確，適用于該類激素的殘留監(jiān)控。

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