呂嘉櫪, 韓 蓉, 沈 文, 王 珊

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

茯磚茶具有顯著的促消化、降血脂、調(diào)節(jié)糖代謝和抑制腫瘤細(xì)胞等功效[1-3].冠突散囊菌是茯磚茶發(fā)花過(guò)程中自然形成的一種優(yōu)勢(shì)菌[4,5].關(guān)于茯磚茶中功能性物質(zhì)報(bào)道較多，而關(guān)于冠突散囊菌的功能性物質(zhì)有一些報(bào)道，但是對(duì)其所產(chǎn)的黃色系物質(zhì)的結(jié)構(gòu)方面研究還很少涉及.王波等[6]人從金花菌中提取獲得了黃色素的提取液，并且推測(cè)該色素溶液中可能含有類胡蘿卜素成分.因此，鑒于前人已對(duì)冠突散囊菌的生物學(xué)特性及生長(zhǎng)條件做了大量的研究工作基礎(chǔ)上，本課題采用麩皮固體培養(yǎng)基培養(yǎng)大量冠突散囊菌，對(duì)其所產(chǎn)黃色系物質(zhì)進(jìn)行提取分離純化，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比性探究，從而推測(cè)出可能的色素類型，為藥品和保健食品的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 冠突散囊菌

由陜西科技大學(xué)微生物研究室從陜西蒼山茶葉有限責(zé)任公司所產(chǎn)茯磚茶中分離純化得到.

1.1.2 培養(yǎng)基

麩皮和水以一定配比混合均勻，于121 ℃滅菌30 min.

1.2 試劑

石油醚(60～90沸程)，丙酮，乙酸乙酯，甲醇，冰乙酸，乙醚均為化學(xué)純；β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 保溫提取單因素實(shí)驗(yàn)[7-9]

2.1.1 料液比單因素實(shí)驗(yàn)

取冠突散囊菌培養(yǎng)物5 g，分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)加入浸提液，50 ℃下保溫提取1 h，過(guò)濾得提取液.測(cè)定并計(jì)算得率.確定最佳料液比.

2.1.2 提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)

取冠突散囊菌培養(yǎng)物5 g，按1∶30的比例加入浸提液，50 ℃下保溫提取0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，過(guò)濾得到提取液.測(cè)定并計(jì)算得率.確定最佳提取時(shí)間.

2.1.3 提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)

取冠突散囊菌培養(yǎng)物5 g，按1∶30的比例加入浸提液，分別在不同溫度30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下，保溫提取1 h，過(guò)濾得到提取液.測(cè)定并計(jì)算得率.確定最佳提取溫度.

2.2 保溫提取正交試驗(yàn)

據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素，采用L9(34)正交表.

表1 試驗(yàn)因素水平

2.3 冠突散囊菌所產(chǎn)黃色系物質(zhì)的純化[10]

取黃色系物質(zhì)粗品50.0 mg經(jīng)石油醚溶解后與少量硅膠拌樣，按濕法上柱進(jìn)行柱層析分離，硅膠柱徑高比1∶10，洗脫液為石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸=40∶10∶5∶1，收集目標(biāo)色素組分，合并、濃縮和結(jié)晶，獲得粉末狀黃色系物質(zhì)精制品；利用薄層層析，選取不同展開(kāi)劑[11,12]，(1)展開(kāi)劑I：石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸=40∶10∶5∶1.(2)展開(kāi)劑II：石油醚∶丙酮=3∶1. (3)展開(kāi)劑Ⅲ：石油醚∶丙酮=7∶3，將黃色系組分進(jìn)行再分離；利用HPLC法，色譜條件為，色譜柱: Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm); 檢測(cè)波長(zhǎng):λmax; 流速: 1 mL/min; 進(jìn)樣量: 20μL; 柱溫: 室溫; 流動(dòng)相: 甲醇-乙腈-二氯甲烷(5∶80∶15)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果加以驗(yàn)證.

2.4 黃色系物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 黃色系物質(zhì)TLC分析

將冠突散囊菌所產(chǎn)黃色系物質(zhì)的石油醚提取液點(diǎn)于薄層板上，將點(diǎn)樣后的薄層板放入展開(kāi)缸中，比較兩種標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的Rf值，確定是否為同類物質(zhì)，點(diǎn)樣順序從左至右依次為：番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品，β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，冠突散囊菌所產(chǎn)黃色系物質(zhì)的石油醚提取液.

2.4.2 黃色系物質(zhì)紫外掃描分析

取一定量的β-胡蘿卜素，番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)液, 以石油醚為空白, 用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)其在300～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描, 確定反應(yīng)液的最大吸收波長(zhǎng).將純化后的黃色系物質(zhì)進(jìn)行同波長(zhǎng)段的紫外掃描，對(duì)照三者紫外掃描圖譜.

2.4.3 黃色系物質(zhì)紅外圖譜分析

將β-胡蘿卜素，番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品和黃色系物質(zhì)進(jìn)行紅外光譜儀掃描，通過(guò)光譜圖分析可能含有的官能團(tuán)，進(jìn)而推測(cè)可能的物質(zhì)結(jié)構(gòu).

3 結(jié)果與討論

3.1 保溫提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 料液比單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 料液比對(duì)黃色系物質(zhì)得率的影響

由圖1可知：當(dāng)料液比從1∶10提高到1∶30，得率有明顯的提高，之后加大料液比，得率也沒(méi)有明顯提高，所以選擇1∶30為最適料液比.

3.1.2 提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 提取時(shí)間對(duì)黃色系物質(zhì)得率的影響

由圖2可知：當(dāng)提取時(shí)間從0.5 h至1 h時(shí)，得率逐漸增大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，得率呈少許下降趨勢(shì)，但1.5 h之后又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，由于得率上升程度不大，所以選1 h作為提取時(shí)間.

3.1.3 提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 提取溫度對(duì)黃色系物質(zhì)得率的影響

由圖3可知：當(dāng)溫度從30 ℃升高到60 ℃時(shí)，得率明顯增大，但繼續(xù)升高溫度，得率略有下降，可能溫度升高使物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，因此，選60 ℃作為提取溫度.

3.2 保溫提取法正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

由表2，3可看出提取條件中各因素的主次為A(料液比)>B(提取溫度)> C(提取時(shí)間),最優(yōu)工藝為A3B2C2，即料液比1∶30，溫度60 ℃，時(shí)間1 h.最高得率可達(dá)0.83%左右.

3.3 黃色系物質(zhì)的純化結(jié)果

利用保溫提取法在料液比1∶30、溫度60 ℃、時(shí)間1 h條件下，提取到粗品得率為0.83%；取粗品50.0 mg，利用柱層析分離，洗脫液為石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸=40∶10∶5∶1，獲得精制品得率為60.8%.

圖4 展開(kāi)劑Ⅰ薄層圖

圖5 展開(kāi)劑Ⅱ薄層圖

圖6 展開(kāi)劑Ⅲ薄層圖

圖7 黃色系物質(zhì)的HPLC圖譜

由圖4～7可知：黃色系物質(zhì)的Rf值主要集中在0.6左右，展開(kāi)劑Ⅰ只分離出一個(gè)黃色斑點(diǎn)；展開(kāi)劑Ⅱ分離效果稍好，有三個(gè)明顯的黃色斑點(diǎn)；展開(kāi)劑Ⅲ將黃色系物質(zhì)分離出4個(gè)斑點(diǎn)，且這四個(gè)斑點(diǎn)極性極為相似.由HPLC圖譜可以看出，黃色系物質(zhì)含有4個(gè)主要峰，進(jìn)一步說(shuō)明黃色系物質(zhì)含有4種主要組分.有此可見(jiàn)：冠突散囊菌所產(chǎn)的黃色系物質(zhì)不是單一組分，是包含了四種主要組分的混合物.

3.4 黃色系物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

3.4.1 薄層結(jié)果

圖8 樣品與標(biāo)品對(duì)照薄層圖

由圖8可知：番茄紅素，β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品與黃色系物質(zhì)的Rf值存在明顯差異，由此可見(jiàn)，此黃色系物質(zhì)和番茄紅素，β-胡蘿卜素可能不是同一類物質(zhì).

3.4.2 紫外掃描結(jié)果分析

圖9 β-胡蘿卜素紫外掃描圖

圖10 番茄紅素紫外掃描圖

圖11 黃色系物質(zhì)紫外掃描圖

如圖9～11所示：β-胡蘿卜素的石油醚溶解液有兩個(gè)較明顯的最大吸收波長(zhǎng)，分別是450 nm和478 nm；番茄紅素的石油醚溶解液有三個(gè)較明顯的最大吸收波長(zhǎng)，分別是444 nm、470 nm和502 nm；黃色系物質(zhì)的石油醚溶解液的最大吸收波長(zhǎng)為394 nm，由此可見(jiàn)，冠突散囊菌所產(chǎn)的黃色系物質(zhì)可能不是β-胡蘿卜素或番茄紅素.

3.4.3 紅外結(jié)果分析

圖12 番茄紅素紅外掃描圖譜

由圖12可知，在2 932 cm-1，1 381 cm-1處有特征吸收峰，可能含有-C-H，-CH3；在1 675 cm-1處有特征吸收，可能含有C=C；在1 452 cm-1處有特征吸收說(shuō)明可能有芳香族化合物；在1 250～1 100 cm-1處沒(méi)有特征吸收，說(shuō)明沒(méi)有C-O單鍵；在2 500～2 000 cm-1處沒(méi)特征吸收峰，說(shuō)明此物質(zhì)中沒(méi)有C≡C.

圖13 β-胡蘿卜素紅外掃描圖譜

由圖13可知，在2 933 cm-1，2 875 cm-1，1 462 cm-1，1 379 cm-1處有特征吸收峰，可能含有-C-H，-CH3；在3 169 處有特征吸收峰，C=C-H；1 462 cm-1處有特征吸收說(shuō)明可能有芳香族化合物；在1 250～1 100 cm-1處沒(méi)有特征吸收，說(shuō)明沒(méi)有C-O單鍵；在2 500～2 000 cm-1處沒(méi)有特征吸收峰，說(shuō)明此物質(zhì)中沒(méi)有C≡C.

由圖14可知，在2 927 cm-1處有特征吸收峰，可能含有-C-H；在1 587 cm-1，1 450 cm-1處有特征吸收說(shuō)明可能有芳香族化合物；在1 160 cm-1處有特征吸收，說(shuō)明可能含有C-O單鍵；在1 621 cm-1處有特征吸收，說(shuō)明有C=C；在2 500～2 000 cm-1出沒(méi)特征吸收峰，說(shuō)明此物質(zhì)中沒(méi)有C≡C.因此，結(jié)合物質(zhì)結(jié)構(gòu)及紅外圖譜分析，冠突散囊菌黃色系物質(zhì)中可能含有C-O單鍵，而兩種標(biāo)準(zhǔn)品中不含有，所以可能不是一類物質(zhì).

圖14 黃色系物質(zhì)紅外掃描圖譜

4 結(jié)束語(yǔ)

保溫提取法對(duì)茯磚茶冠突散囊菌所產(chǎn)黃色系物質(zhì)得率影響的主次順序?yàn)椋毫弦罕?提取溫度>提取時(shí)間,即料液比1∶30，溫度60 ℃，時(shí)間1 h.最高得率可達(dá)0.83%左右.通過(guò)TLC法，紫外光譜及紅外光譜法，分析了β-胡蘿卜素、番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品和冠突散囊菌所產(chǎn)黃色系物質(zhì)的極性、最大吸收波長(zhǎng)、物質(zhì)含有官能團(tuán)等方面的差異，確定此黃色系物質(zhì)不是β-胡蘿卜素、番茄紅素一類，且組分并不單一，是由四種結(jié)構(gòu)類似物構(gòu)成的混合物質(zhì).根據(jù)紅外光譜圖所顯示的官能團(tuán)，推測(cè)還有可能是葉黃素一類.關(guān)于黃色系物質(zhì)結(jié)構(gòu)的確定是十分復(fù)雜的問(wèn)題，可進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分離純化，針對(duì)各個(gè)組分做質(zhì)譜、核磁等方面的檢測(cè).具體結(jié)構(gòu)鑒定仍需進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)加以驗(yàn)證.

[1] 余智勇.茯磚茶抗腹瀉作用研究[D].長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[2] 宋魯彬,黃建安,劉仲華,等.中國(guó)黑茶對(duì)消化道腫瘤的作用[J].茶葉科學(xué),2009,29(3):191-195.

[3] 宋魯彬.中國(guó)黑茶藥理功能評(píng)價(jià)及活性物質(zhì)研究[D].長(zhǎng)沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[4] 齊祖同,孫曾美.茯磚茶中優(yōu)勢(shì)菌種的鑒定[J].真菌學(xué)報(bào),1990,9(3):176-179.

[5] 劉作易.一種決定茯磚茶品質(zhì)的重要真菌-“金花”菌的研究進(jìn)展[J].貴州茶葉,1993,2(74):33-35.

[6] 王 波,于漢壽,劉雪慧,等.散囊菌黃色素的提取及穩(wěn)定性研究[J].生物學(xué)雜志,2009,26(3):63-65.

[7] Jongrungchok S,Kittakoop P,Yongsmith B.Azaphilone pigments from a yellow mutant of the fungus monascus kaoliang[J].Photo-chemistry,2004,65:2 569-2 575 .

[8] 王偉霞,李福后,浦寅芳.海洋紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2007,28(10):55-57.

[9] 胡曉丹,謝筆鈞.金盞菊花類胡蘿卜素的提取及性質(zhì)研究[J].食品科技,2001(3):35-37.

[10] 邸進(jìn)申，王艷艷，番茄紅素的層析分離[J].精細(xì)化工,2003,20(4)：215-217.

[11] 黃孝原.茶葉中葉綠素與類胡蘿卜素組分的薄層掃描定量法.中國(guó)茶葉,1989,11(6):24-26.

[12] 劉仲華.茯磚茶加工中色素物質(zhì)的變化與色澤品質(zhì)的形成.茶葉科學(xué)，1991(11):76-80.