陳 合， 李串娜， 舒國偉， 羅 茜

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

保加利亞乳桿菌屬于革蘭氏陽性，厭氧細(xì)菌.單個(gè)個(gè)體成長桿狀或鏈狀，兩端橢圓，不具運(yùn)動(dòng)性，也不會(huì)產(chǎn)生孢子.它屬于化能異養(yǎng)型微生物，最適生長溫度一般為37～45 ℃，溫度高于50 ℃或低于20 ℃則不能生長.

保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus,LB)是有益于人體健康的益生菌之一[1]，主要存在于人體腸道，可降低腸道內(nèi)的pH值，抑制腸道中腐敗菌的生長并減弱腐敗菌在腸道內(nèi)的產(chǎn)毒作用，防治細(xì)胞老化，降低膽固醇及調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能等醫(yī)療保健作用.因此，正受到越來越多消費(fèi)者的歡迎和喜愛[2-4].

目前，凍干菌粉的制備多采用真空冷凍干燥法[5].但其中冷凍和干燥兩個(gè)過程均會(huì)造成微生物細(xì)胞不同程度的損傷、死亡及某些酶蛋白的鈍化.如果菌體直接進(jìn)行冷凍干燥，存活率只有10～30%左右[6-8]，若將菌體懸浮于適宜的介質(zhì)中再進(jìn)行冷凍干燥，菌體的存活率可達(dá)到70%以上.因此，選擇合適的凍干保護(hù)劑非常必要.

保護(hù)劑可以改變生物樣品冷凍干燥時(shí)的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥或復(fù)水對細(xì)胞的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性[9,10].凍干保護(hù)劑不僅影響乳酸菌在凍干過程中的細(xì)胞存活率，還影響保藏期間的細(xì)胞穩(wěn)定性[11].

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是使用正交表來安排多因素多水平試驗(yàn)，并采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析結(jié)果的一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法.它不僅可以解決多因素選優(yōu)問題，而且還可以用來分析各因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的大小，從而找出主要因素.

本課題組在前期通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化篩選了對保加利亞乳桿菌生長影響較為顯著的幾種氮源，初步確定了3種氮源的添加量[8].本研究則通過單因素實(shí)驗(yàn)研究了乳糖、脫脂乳粉、蔗糖和抗壞血酸鈉等4種物質(zhì)對該菌的凍干存活率及菌粉活菌數(shù)的影響；在此基礎(chǔ)上，并采用正交實(shí)驗(yàn)對保加利亞乳桿菌的抗凍保護(hù)劑進(jìn)行了優(yōu)化，從而為保加利亞乳桿菌凍干菌粉的生產(chǎn)提供了一定的參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/100mL)：葡萄糖2，蛋白胨1，牛肉膏0.8，酵母浸粉0.4，檸檬酸二銨0.2，磷酸氫二鉀0.2，乙酸鈉0.5，MgSO40.02，MnSO40.004，吐溫-80 0.1 mL.

118 ℃滅菌15 min，用于菌種的活化、培養(yǎng)及計(jì)數(shù).

1.1.2 主要試劑與儀器

試劑：蔗糖，乳糖、脫脂乳粉和抗壞血酸鈉及以上MRS培養(yǎng)基中所用試劑均為生化試劑級.

儀器：SW-CJ-1F 無菌操作臺(tái)，蘇州凈化；DH5000AB 電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；手提式蒸汽壓力滅菌器，江陰濱江醫(yī)療器械廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；LG10-2.4離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；FD-1D-50真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

菌種活化→菌種培養(yǎng)→離心收集菌泥→加保護(hù)劑→預(yù)凍→真空冷凍(24 h)→復(fù)水→活菌計(jì)數(shù).

1.2.2 菌種活化

將LB以2%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，活化三次，鏡檢無雜菌后，置于4 ℃冰箱保存.

1.2.3 菌體培養(yǎng)及收集

將活化好的LB以4%(V/V)接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h.然后將培養(yǎng)液置于離心管中，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，倒掉上清液，從而獲得菌泥.

1.2.4 冷凍干燥工藝

向菌泥中加入保護(hù)劑后，于-40 ℃冰箱內(nèi)預(yù)凍4 h，然后置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，于-51 ℃、6.93 Pa下凍干24 h.

1.3 測定方法

1.3.1 菌體形態(tài)觀察

采用甲苯胺藍(lán)染色法：在涂片上滴加0.2%的甲苯胺藍(lán)染色液，酒精燈上稍加熱后移開，置于室溫下染色2 min 后水洗，然后用1%的乙酸脫色1～2 s 后用水沖去，用濾紙吸干周圍多余的水分或自然干燥后鏡檢.

1.3.2 活菌數(shù)測定

(1)冷凍干燥前對菌懸液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù).(2)冷凍干燥后，用30 mL滅菌后的生理鹽水復(fù)水凍干菌粉再進(jìn)行活菌計(jì)數(shù).通過梯度稀釋法，將菌懸液適當(dāng)稀釋，選擇合適的稀釋度取0.1 mL接種于MRS計(jì)數(shù)培養(yǎng)基中，涂布均勻后，于37 ℃培48～72 h后，選30～300個(gè)之間的菌落數(shù)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度做三個(gè)求均值.

1.3.3 存活率和菌粉活菌數(shù)計(jì)算

存活率(%)=凍干后總活菌計(jì)數(shù)/凍干前總活菌計(jì)數(shù)×100%

菌粉活菌數(shù)(cfu/g)=凍干后總活菌數(shù)×菌懸液體積/菌粉重

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖對保加利亞乳桿菌凍干效果的影響

保加利亞乳桿菌經(jīng)過三次活化后，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h，然后于8 000 r/min、離心15 min，倒掉上清液，獲得菌泥，向菌泥中加入蔗糖保護(hù)劑，使蔗糖濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%，并補(bǔ)充磷酸緩沖液使添加物總量與菌泥等重，預(yù)凍后進(jìn)行凍干.凍干存活率與菌粉活菌數(shù)如圖1所示.

圖1 蔗糖對保加利亞乳桿菌凍干的影響

從圖1中可以看出，隨著蔗糖濃度的增加，保加利亞乳桿菌的存活率不斷增加，菌粉活菌數(shù)先減小后增加，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到25%時(shí)，菌體的存活率為24.5%，菌粉活菌數(shù)達(dá)到0.692×1011cfu/g.

2.2 乳糖對保加利亞乳桿菌凍干效果的影響

保加利亞乳桿菌經(jīng)活化，培養(yǎng)后離心獲得菌泥，再加入乳糖，使乳糖濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%，并補(bǔ)充磷酸緩沖液，凍干后結(jié)果如圖2所示.

圖2 乳糖對保加利亞乳桿菌凍干的影響

從圖2可以看出，保加利亞乳桿菌存活率和菌粉活菌數(shù)隨著乳糖濃度的變化而變化，當(dāng)乳糖濃度達(dá)到20%時(shí)，菌體存活率達(dá)到最高值35.6%；當(dāng)乳糖濃度25%時(shí)，菌粉活菌數(shù)達(dá)到最大值為0.983×1011cfu/g.

2.3 脫脂乳粉對保加利亞乳桿菌凍干效果的影響

保加利亞乳桿菌經(jīng)活化后，培養(yǎng)離心獲得菌泥，再加入脫脂乳粉，使脫脂乳粉濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%，并補(bǔ)充磷酸緩沖液，凍干后結(jié)果如圖3所示.

從圖3可以看出，隨著脫脂乳粉濃度的變化，保加利亞乳桿菌存活率和活菌數(shù)隨之變化，當(dāng)脫脂乳粉濃度達(dá)到25%時(shí)，菌體存活率達(dá)到最大值64.4%；當(dāng)脫脂乳粉濃度20%時(shí)，菌粉活菌數(shù)達(dá)最大值1.68×1011cfu/g.

圖3 脫脂乳粉對保加利亞乳桿菌凍干的影響

2.4 抗壞血酸鈉對保加利亞乳桿菌凍干效果的影響

保加利亞乳桿菌經(jīng)活化后，培養(yǎng)離心獲得菌泥，加入抗壞血酸鈉，設(shè)置抗壞血酸鈉濃度分別為1.5%、3.0%、4.5%、6.0%、7.5%，并補(bǔ)充磷酸緩沖液，使添加物總量與菌泥等重，凍干后結(jié)果如圖4所示.

圖4 抗壞血酸鈉對保加利亞乳桿菌凍干的影響

從圖4中可以看出，當(dāng)抗壞血酸鈉濃度達(dá)到4.5%時(shí)，保加利亞乳桿菌的存活率和活菌數(shù)均達(dá)到最大值84.7%和0.51×1011cfu/g，因此，4.5%的抗壞血酸鈉濃度在保加利亞乳桿菌凍干過程中，保護(hù)效果最好.

2.5 最佳凍干保護(hù)劑的確定

在單因素的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對蔗糖(A)、乳糖(B)、脫脂乳粉(C)和抗壞血酸鈉(D)4個(gè)因素進(jìn)行考察，分析篩選出影響較大的因素及最佳凍干保護(hù)劑配方，各種保護(hù)劑水平設(shè)計(jì)見表1，其響應(yīng)值Y為保加利亞乳桿菌存活率，Y′為保加利亞乳桿菌菌粉活菌數(shù)(×1011cfu/g).試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表1極差R、R′分析可知，4種保護(hù)劑對菌種存活率及活菌數(shù)影響的主次因素是一致的，由大到小順序?yàn)锳>C>D>B，即蔗糖對存活率和活菌數(shù)影響最大，其次是脫脂乳粉、抗壞血酸鈉、乳糖.

根據(jù)極差分析，存活率及活菌數(shù)最高組的最佳組合為A1B2C2D3，因?yàn)檫@個(gè)組合不在已做的9次試驗(yàn)中，所以又做了A1B2C2D3進(jìn)行了驗(yàn)證.發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌的存活率為94%，菌粉的活菌數(shù)為1.926×1011cfu/g，均高于表1中的存活率和菌粉活菌數(shù)，所以最佳組合為A1B2C2D3，即最佳凍干保護(hù)劑配方為:30%蔗糖+20%脫脂乳+4.0%抗壞血酸鈉+20%乳糖.

3 結(jié)論

保加利亞乳桿菌的最佳保護(hù)劑配方為：30%蔗糖+20%脫脂乳粉+4.0%抗壞血酸鈉+20%乳糖.該復(fù)配保護(hù)劑能使保加利亞乳桿菌在真空冷凍干燥中的存活率達(dá)到94%，菌粉的活菌數(shù)達(dá)1.926×1011cfu/g.

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