陳松林

（江蘇省如皋市畜牧獸醫(yī)站，江蘇如皋 226500）

豬鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

陳松林

（江蘇省如皋市畜牧獸醫(yī)站，江蘇如皋 226500）

豬鏈球菌病是由多種不同群的致病性鏈球菌引起的動物和人類共患的1種細(xì)菌性傳染病。其特征主要表現(xiàn)：急性病例常為敗血癥和腦膜炎，慢性病例則為關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎及組織化膿性炎等。本病呈世界性分布，發(fā)病率和死亡率均較高，給養(yǎng)豬業(yè)與人類的健康造成很大的威脅。1998年以來，如皋市部分養(yǎng)殖場（戶）出現(xiàn)了來勢猛烈、傳播快、病程短、死亡率高的敗血型鏈球菌病，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。尤其自2005年6月四川資陽發(fā)生豬鏈球菌2型感染人的事件后，鏈球菌病的防控再次成為生豬疫病防控的焦點(diǎn)。為了更好地抑制本病，在如皋市大規(guī)模流行期間，我們進(jìn)行了豬鏈球菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，提高了本病的治愈率，現(xiàn)將試驗(yàn)過程和步驟報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2006年7月無菌采集如皋市搬經(jīng)鎮(zhèn)某發(fā)病豬場的2頭疑似鏈球菌病的病死豬的肺臟、心血、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、心包液和病變關(guān)節(jié)液。

1.2 主要試劑及儀器

鮮血瓊脂、普通瓊脂、麥康凱瓊脂、半固體糖發(fā)酵培養(yǎng)基、血清肉湯培養(yǎng)基、匹克氏增菌液按常規(guī)方法制備。

1.3 細(xì)菌的分離鑒定及結(jié)果

1.3.1 細(xì)菌的分離 將所采病料分別涂片，革蘭氏染色鏡檢，可見細(xì)菌為革蘭氏陽性，菌體呈圓形、雙球形或短鏈狀，無鞭毛，無芽胞，不運(yùn)動，無莢膜，無粘液層，無兩極著色現(xiàn)象。無菌采取病料于鮮血瓊脂平板上劃線分離，37℃有氧條件培養(yǎng)24 h，可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落經(jīng)涂片、染色、鏡檢，證實(shí)為純培養(yǎng)物，將其接種于鮮血瓊脂斜面上進(jìn)行培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)物。

1.3.2 培養(yǎng)特性試驗(yàn) 分離菌接種于血清肉湯、普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板，麥康凱瓊脂平板等培養(yǎng)基中，37℃有氧條件下培養(yǎng)觀察其生長表現(xiàn)。同時(shí)，另1組置于厭氧罐中37℃培養(yǎng)觀察其生長表現(xiàn)。結(jié)果分離菌為兼性厭氧菌，無運(yùn)動性，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長極貧瘠，培養(yǎng)24 h后僅在劃線處見有針尖大小的菌落；血清肉湯中血清肉湯渾濁，不形成菌膜，培養(yǎng)48 h后上清較透明，底部有顆粒狀沉淀。在血瓊脂平板上生長好，37℃、24 h即能長出灰白色、圓形、透明、閃光、中央隆起、表面光滑露珠狀小菌落，菌落周圍呈β溶血，在麥康凱瓊脂平板上不生長。

1.3.3 生化試驗(yàn) 用分離菌純培養(yǎng)物進(jìn)行蔗糖、山梨醇、棉實(shí)糖、葡萄糖、甘露醇、蕈糖、乳糖、菊糖、水楊苷、馬尿酸鈉試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果詳見表1。

表中表明分離細(xì)菌的生化反應(yīng)結(jié)果均符合豬鏈球菌的生化特性，說明分離的菌為豬鏈球菌。

1.3.4 血清學(xué)試驗(yàn) 經(jīng)對豬鏈球菌分離菌群送檢，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)陽性血清玻片凝集試驗(yàn)，結(jié)果表明為豬鏈球菌2型。

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合臨床癥狀和病理變化確定病死豬的致死病因?yàn)樨i鏈球菌。

2 藥敏試驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

普通麥糠凱培養(yǎng)基：江蘇省衛(wèi)生防疫站自由選擇試劑廠生產(chǎn)。

藥敏試紙：杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)和自制。

細(xì)菌：本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定培養(yǎng)的鏈球菌。

儀器：接種環(huán)、酒精燈、打孔器、移液器、滴頭等。

2.2 藥敏片試驗(yàn)法

（1）在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量鏈球菌的菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式：用滅菌接種環(huán)取適量鏈球菌分別在平皿邊緣相對4點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第2點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至鏈球菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試鏈球菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢鏈球菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密，直接懸液法要把菌液濃度用生理鹽水或PBS調(diào)到0.5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)再涂布均勻。）

（2）將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼1片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼7片），每種藥敏片的名稱要記住。

（3）將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察效果。

2.3 結(jié)果判定

在涂有鏈球菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的鏈球菌生長受到抑制。過夜培養(yǎng)后形成1個(gè)抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細(xì)菌濃度有直接關(guān)系。

2.3.1 判定標(biāo)準(zhǔn)

藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果詳見表2。

表2 藥物敏感試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

2.3.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果如下：極敏：阿莫西林、頭孢拉定、頭孢曲松；

高敏：青霉素、氨芐西林、卡那霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星；中敏：阿米卡星、慶大霉素；低敏：多西環(huán)素、鏈霉素。

2.4 藥敏試驗(yàn)的應(yīng)用

（1）選擇極敏或高敏藥物進(jìn)行治療，避免盲目用藥；（2）根據(jù)不同地區(qū)和藥物使用選擇敏感藥物；（3）選用幾種有效藥物交替使用，以降低耐藥性的產(chǎn)生。