黃秀香，李曉東，勞德永

（河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西宜州546300）

中藥半枝蓮為唇形科植物半枝蓮（Scutellaria barbata D．Don）的干燥全草。具有解熱、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[1]。半枝蓮含有多糖、生物堿、黃酮甙、甾體以及酚類、鞣質(zhì)等。多糖是一類重要的活性物質(zhì)，特別在抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)免疫力等方面受到越來越多藥學(xué)研究工作者的關(guān)注。多糖類是保健食品中真正起作用的生理活性部分，是保健食品的核心。多糖是半枝蓮中一種重要的活性成分，因此，對(duì)半枝蓮多糖最佳提取工藝及抗氧化研究有很高的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)研究了超聲波輔助半仿生法在半枝蓮多糖提取中的可行性，用正交試驗(yàn)對(duì)此工藝進(jìn)行優(yōu)化，尋求最佳的提取工藝條件，并對(duì)半枝蓮多糖抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為半枝蓮藥理作用的進(jìn)一步研究和半枝蓮資源的合理開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

半枝蓮干品（購(gòu)于廣西宜州市）；葡萄糖、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、95 %乙醇、鹽酸、磷酸氫二鈉、K3Fe（CN）6、三氯乙酸、FeCl3、鄰二氮菲、FeSO4、H2O2、石油醚，以上藥品均為分析純。

UV－2501 紫外分光光度計(jì)：日本島津；AR224CN型電子分析天平：奧豪斯儀器有型公司；KQ2200DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-25 型數(shù)顯pH 計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 半枝蓮多糖提取工藝

根據(jù)仿生學(xué)原理，模仿人體胃、小腸pH 分別為2.0、7.5。準(zhǔn)確稱取1 g 半枝蓮樣品，第一次提?。河胮H已調(diào)至2.0 的蒸餾水作為浸劑，在一定提取時(shí)間、料液比、提取溫度、超聲功率下進(jìn)行多糖提取，過濾，保留濾液、濾渣。第二次提?。河胮H 為7.5 的蒸餾水作提取劑，在相同的提取時(shí)間、超聲功率、料液比、提取溫度下對(duì)第一次提取后的濾渣進(jìn)行多糖提取，過濾。合并兩次濾液，加入活性炭脫色，減壓抽濾，濾液濃縮，用95%乙醇沉淀，常壓過濾，用無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，在烘箱中60 ℃烘干即得到半枝蓮粗多糖。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[2]

準(zhǔn)確稱取105 ℃下干燥的無水恒重葡萄糖0.100 0 g，溶于100 mL 容量瓶中，定容，搖勻，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 濃度為1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL 容量瓶中，定容，搖勻，分別吸取定容后的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液2.0 mL 于10 mL 具塞比色管中，以蒸餾水為空白對(duì)照，加入1.0 mL5%苯酚溶液、5.0 mL濃硫酸，室溫靜置30 min，在波長(zhǎng)為490 nm 下測(cè)定吸光度，以吸光度A 為縱坐標(biāo)，濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 換算因子的測(cè)定[3]

準(zhǔn)確稱取半枝蓮多糖121 mg 置于100 mL 容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取配置好的多糖溶液4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL 于50 mL 容量瓶中，定容后分別吸取2 mL 于比色管中，加入1 mL新配置的5%苯酚和5 mL 濃硫酸，振蕩，靜置30 min后測(cè)定其吸光度。

1.2.2.3 樣品中總糖含量測(cè)定[4]

吸取樣品液1.0 mL，按1.2.2.1 操作，測(cè)定吸值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖得率。多糖得率計(jì)算：多糖得率/%=（CDf×100%）/W（式中：C 是半枝蓮多糖溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度；D 是多糖溶液的稀釋倍數(shù)；f 是換算因子；W 是半枝蓮樣品的質(zhì)量）。

1.2.3 多糖提取條件的優(yōu)化

分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，對(duì)比不同提取時(shí)間、料液比、超聲功率、提取溫度對(duì)多糖得率的影響，在單因素的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)半枝蓮多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3 抗氧化試驗(yàn)

1.3.1 還原能力的測(cè)定[4]

配制濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL 的多糖液，分別加入pH 為6.6 的磷酸鹽緩沖液和1 %K3Fe（CN）6溶液各2.5 mL 并混合均勻，混合液在50 ℃下保溫20 min 后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混合后在3 000r/min離心10min。取上清液0.5mL，加入5.0mL 蒸餾水及0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，在700 nm 處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度。以VC作對(duì)比，每組3 個(gè)平行。

1.3.2 對(duì)羥基自由基清除作用的測(cè)定[4]

取1 mL 5 mmol/L 鄰二氮菲，加2.0 mL pH7.4 的磷酸鹽緩沖液，充分搖勻，加1.0 mL 7.5 mmol/LFeSO4，搖勻，加1.0 mL 0.2%H2O2，最后加入5 mL 重蒸水，在37 ℃水浴下反應(yīng)60 min，然后在536 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A損傷。未損傷管以1mL 重蒸水代替損傷管中1mL 0.2%的雙氧水，操作同損傷管，可測(cè)得未損傷管的吸光度值A(chǔ)未損傷。樣品管分別以1 mL 濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的多糖液和4 mL 的重蒸水代替損傷管的5 mL 重蒸水，操作同損傷管，可測(cè)得樣品管的吸光度值A(chǔ)樣。以VC作對(duì)比，每組3 個(gè)平行。

羥基自由基清除率d 計(jì)算公式：

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作結(jié)果

根據(jù)1.2.2.1 制作得到回歸方程為：Y=12.121X+0.008 1，R2=0.999 2。

2.2 換算因子計(jì)算結(jié)果

根據(jù)1.2.2.2 測(cè)定的吸光度以及回歸方程，按下式計(jì)算換算因子：f＝w/（C×D）（式中：w 是稱取多糖的質(zhì)量；C 是多糖中葡萄糖的質(zhì)量濃度；D 是半枝蓮多糖的稀釋倍數(shù)），經(jīng)計(jì)算得f=2.7。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取半枝蓮1.000 0 g，在提取溫度50 ℃，料液比1 ∶25（g/mL），超聲功率70 W，pH 分別為2.0、7.5時(shí)提取多糖，結(jié)果如圖1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction yield

半枝蓮多糖的得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在25 min 時(shí)提取率達(dá)到最大，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率減小，由于在一定溫度下多糖部分水解所造成的。故選擇提取時(shí)間在20 min～30 min 作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的提取時(shí)間范圍。

2.3.2 料液比對(duì)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取半枝蓮1.000 0 g，在提取溫度50 ℃，超聲功率70 W，提取時(shí)間25 min，pH 分別為2.0、7.5 時(shí)提取多糖。料液比分別為1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL），結(jié)果如圖2。

圖2 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of weight ratio of scutellaria barbata D．Don to ethanol on the extraction yield

多糖的提取率隨著料液比的增大而增大，料液比達(dá)到1 ∶20 時(shí)多糖的提取率達(dá)到最大，隨著料液比的繼續(xù)增大，多糖的提取率反而減小，這可能是多糖的溶出量已達(dá)到平衡，過多的溶劑造成多糖的濃度變小。故選擇料液比1 ∶20（g/mL）～1 ∶30（g/mL）作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的料液比范圍。

2.3.3 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取半枝蓮1.000 0 g，在提取時(shí)間25 min，溫度50 ℃，料液比1 ∶20（g/mL），pH 值分別為2.0、7.5 時(shí)提取多糖，超聲功率分別為50、60、70、80、90 W，結(jié)果如圖3。

圖3 超聲功率對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of power on the yield of polysaccharide

由圖3 可知，多糖的提取率隨著超聲功率的增大而增加，到80 W 時(shí)提取率達(dá)到最大，當(dāng)功率大于80 W后多糖的提取率降低，原因可能是功率過高破壞了多糖結(jié)構(gòu)。90 W 時(shí)的提取率與60 W 的基本相同，但90 W時(shí)耗能較大，因此，選擇60 W～80 W 作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的超聲功率范圍。

2.3.4 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取半枝蓮1.000 0 g，在提取時(shí)間25 min，料液比1 ∶20（g/mL），功率70 W，pH 分別為2.0、7.5 時(shí)提取多糖，提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，結(jié)果如圖4。

圖4 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the yield

由圖4 可知，隨著提取溫度的升高多糖的提取率略有增大，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)提取率反而降低，原因可能是較高的溫度破壞了多糖結(jié)構(gòu)。因此，選擇40 ℃～60 ℃作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的提取溫度范圍。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選多糖提取工藝

2.4.1 正交試驗(yàn)因素與水平的選擇

根據(jù)單因素的最佳工藝范圍，設(shè)計(jì)因素水平表。見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels

2.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

從表2 可以看出，各因素對(duì)提取效果影響的主次順序?yàn)樘崛r(shí)間＞提取溫度＞超聲功率＞料液比。最佳提取條件為A3B2C2D3，即提取時(shí)間30 min，料液比1 ∶25（g/mL），超聲功率70 W，提取溫度60 ℃。在最佳工藝條件下提取多糖得率為1.48%，RSD 為1.29%。

2.5 半枝蓮多糖抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 還原能力的測(cè)定結(jié)果

還原能力的測(cè)定結(jié)果見圖5。

圖5 半枝蓮多糖還原能力測(cè)定Fig.5 Reducing power of polysaccharide from scutellaria barbata D．Don

由圖5 可知，半枝蓮多糖具有還原能力，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原能力隨多糖濃度增加而增強(qiáng)。但與VC相比，其還原力較弱。

2.5.2 對(duì)羥基自由基清除作用的測(cè)定結(jié)果

對(duì)羥基自由基清除作用的測(cè)定結(jié)果，見圖6。

圖6 半枝蓮多糖對(duì)·OH 清除作用的測(cè)定Fig.6 The scavenging effects of polysaccharide on·OH

由圖6 可知，半枝蓮多糖液對(duì)羥基自由基有清除作用，在一定濃度范圍內(nèi)，清除率隨多糖液濃度增大而增強(qiáng)，半枝蓮多糖對(duì)超氧自由基的IC50為1.70 mg/mL，VC的IC50為1.61 mg/mL，半枝蓮多糖對(duì)超氧自由基的清除能力略低于VC。

3 結(jié)論

采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖含量，以多糖提取率為考察指標(biāo)，用正交試驗(yàn)法L9（34）對(duì)實(shí)驗(yàn)的提取時(shí)間、料液比、超聲功率、提取溫度4 個(gè)因素進(jìn)行考察，確定最佳提取工藝為A3B2C2D3，即提取時(shí)間30 min，料液比1 ∶25（g/mL），超聲功率70 W，提取溫度60 ℃，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，在此最優(yōu)條件下半枝蓮多糖的提取率最高為1.48 %，RSD 為1.29 %，說明該工藝可行、穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果表明半枝蓮多糖具有抗氧化性且在一定的濃度范圍內(nèi)，抗氧化能力隨濃度的增大增強(qiáng)，超過一定濃度時(shí)，抗氧化能力趨于平穩(wěn)，且比VC較弱。

本研究利用超聲輔助半仿生法提取，提高了半枝蓮多糖提取的效率，為半枝蓮多糖提取的最佳工藝研究提供了參考，同時(shí)也為半枝蓮多糖的抗氧化性研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)大面積篩選抗氧化藥物有重要的價(jià)值，對(duì)半枝蓮的進(jìn)一步的研究和開發(fā)利用有重要意義。

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