張然，徐燕杰，王晶，王立梅，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點實驗室，江蘇常熟215500）

芡實為睡蓮科植物芡的干燥成熟種仁。芡實不僅具有食用價值，而且藥用范圍廣泛，屬藥食兩用食品，近年來對芡實進(jìn)行的大量研究發(fā)現(xiàn)芡實含有大量對人體極為有益的成分，如：多糖、維生素、黃酮類化合物、糖苷、生育酚等。芡實葉為芡實加工的副產(chǎn)品，其黃酮類化合物含量較芡實果皮、芡實莖更高[1]，很多研究表明[2-4]黃酮類化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒、舒張冠狀血管等藥理作用。本文利用大孔樹脂分離純化芡實葉黃酮類物質(zhì)，對充分利用芡實產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)品、促進(jìn)芡實產(chǎn)業(yè)發(fā)展有實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

芡實葉：購自蘇州創(chuàng)德興芡實有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；大孔吸附樹脂（AB-8，D101，HPD100，HZ801）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；其它試劑均為分析純。

1.1.2 實驗儀器

玻璃層析柱（Ф2×40cm 徑高比1 ∶20）；TDLSO2B臺式高速離心機：上海利鑫堅離心機有限公司；UV 紫外分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；DBS-160F 自動部分收集器：上海精科實業(yè)有限公司；恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-ⅢA）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市華美生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 芡實葉原料預(yù)處理

將新鮮芡實葉用0.1%的氯化鈉磷酸水溶液浸泡3 min，放入水中沖淋20 min～30 min，取出切小片陰干后烘干至恒重，研磨粉碎，過60 目篩備用。

1.2.2 大孔吸附樹脂預(yù)處理

稱取0.5 BV（bed volume）的大孔吸附樹脂，用1 BV乙醇浸泡樹脂24 h，濕法裝柱，然后用2 BV 的乙醇以2 BV/h 流速通過樹脂柱，浸泡4 h～5 h，再用蒸餾水洗至無白色渾濁現(xiàn)象。用2 BV 的5%HCL 溶液以4 BV/h～6 BV/h 的流速通過樹脂層，并浸泡樹脂2 h～4 h；而后用蒸餾水洗至流出液中性。用2 BV 的2%NaOH 溶液以4 BV/h～6 BV/h 流速通過樹脂層，并浸泡2 h～4 h 而后用蒸餾水洗至流出液中性。

1.2.3 上樣液制備

定量稱取芡實葉粉末干品，按料液比1 ∶25 加入體積分?jǐn)?shù)85%的乙醇，在175 W 的超聲波功率下空化40 min，離心，收集上清液，上樣前用蒸餾水將上清液定容成所需濃度即為上樣液[1]。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取經(jīng)105 ℃干燥到恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品10.00 mg，用95 % 乙醇溶液定容至100 mL 即得0.10 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、4.5 mL，分別用30%乙醇溶液補充至5mL 再分別加入5%NaNO2溶液0.3 mL，然后分別加入0.3 mL 10%Al（NO3）3溶液，再分別加入4%NaOH 溶液2 mL，最后分別用30%乙醇溶液稀釋至10.0 mL，放置15 min～20 min 后在該物質(zhì)的最大吸收峰λ＝510 nm 處測吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得吸光度（A）與蘆丁質(zhì)量濃度（C）之間的回歸方程為：A ＝10.139C-0.006 4；R2=0.999 6。

用標(biāo)準(zhǔn)曲線法在相同條件下測定各樣品吸光度，同標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中黃酮類物質(zhì)含量。

1.2.5 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附率測定

準(zhǔn)確稱取經(jīng)處理的4 種不同型號（AB-8，D101，HPD100，HZ801）大孔吸附樹脂（用濾紙吸干）5 g，置于三角瓶中，加入濃度1.0 mg/mL 芡實葉黃酮類物質(zhì)提取液100 mL，置于搖床中（25 ℃，150 r/min）靜態(tài)吸附24 h，過濾；按照1.2.4 方法測濾液的吸光度，計算出C1值。按下式計算各樹脂室溫下的靜態(tài)吸附量（mg/g）：

式中：Q 為靜態(tài)吸附量，（mg/g）；C0為初始濃度，（mg/mL）；C1為剩余濃度，（mg/mL）；V 為溶液體積，mL；W 為樹脂質(zhì)量，g。

假設(shè)吸附前后溶液體積不變，按下式計算吸附率：

1.2.6 大孔吸附樹脂解吸率測定

取上述吸附飽和的大孔吸附樹脂用蒸餾水洗至洗脫液無色，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，置于250 mL 三角瓶中，加入50 mL 90%乙醇溶液置于搖床中（25 ℃，150 r/min）進(jìn)行靜態(tài)解吸24 h，將樹脂濾出，測定濾液中黃酮類物質(zhì)的濃度，并按下式計算解吸率：

式中：C2為解吸液濃度，（mg/mL）；C0為初始濃度，（mg/mL）；C1為剩余濃度，（mg/mL）。

1.2.7 芡實葉黃酮類物質(zhì)純度測定方法

芡實葉黃酮類物質(zhì)提取液中黃酮類物質(zhì)濃度乘以提取液體積得芡實葉中黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量A，然后將該提取液利用電熱恒溫干燥箱干燥，測得產(chǎn)品干燥后的質(zhì)量B，按下式求出產(chǎn)品中黃酮類物質(zhì)的純度：

式中：A 為芡實葉中黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量，g；B 為提取液干燥后的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附與解吸試驗

2.1.1 不同大孔吸附樹脂的篩選

不同大孔吸附樹脂的篩選結(jié)果見表1。

表1 不同大孔吸附樹脂對芡實葉黃酮類物質(zhì)的吸附率及解吸率Table 1 The adsorption and desorption rate of diffrent resins to flavonoids from euryale ferox leaves

由表1 可看出，HPD100 和AB-8 大孔吸附樹脂的吸附率和解吸率均較高。影響樹脂吸附性能的因素很多，其吸附性能的優(yōu)劣由其化學(xué)和物理結(jié)構(gòu)所決定，樹脂的極性和空間結(jié)構(gòu)（孔徑、比表面積）是影響吸附性能的重要因素。

2.1.2 AB-8 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)研究

取HPD100 和AB-8 大孔吸附樹脂各5 g，分別加入50 mL 芡實葉黃酮類物質(zhì)提取溶液，每隔1 小時取1 mL 樣液進(jìn)行測定，直至達(dá)到平衡為止，得到樹脂的吸附動力學(xué)曲線，見圖1。

圖1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線Fig.1 Kinetics curve of static adsorption of macroporous resin

由圖1 可以看出，HPD100 大孔吸附樹脂在起始階段吸附量小，達(dá)到吸附平衡時間需6 h，飽和吸附量大；AB-8 大孔吸附樹脂在0 h～3 h 內(nèi)對芡實葉黃酮類物質(zhì)的吸附量隨時間的增加而迅速增大，在3 h～5 h內(nèi)，吸附量的增加不明顯，在5 h 以后，大孔吸附樹脂對芡實葉黃酮類物質(zhì)的吸附量幾乎無變化，飽和吸附量略低于HPD100。由于AB-8 大孔吸附樹脂是一種球狀、弱極性吸附劑，屬于弱酸性、弱極性型吸附樹脂[5]，在其結(jié)構(gòu)中僅有非離子化功能基，并附加親水基團(tuán)以及獨特的加工方法，AB-8 大孔吸附樹脂具有相當(dāng)大的比表面積和適宜的孔徑，較適于芡實葉黃酮類化合物的純化。且AB-8 大孔吸附樹脂屬于快速吸附樹脂，可以節(jié)省時間，縮短生產(chǎn)周期。綜上考慮，選擇AB-8大孔吸附樹脂作進(jìn)一步試驗。

2.2 大孔吸附樹脂吸附芡實葉黃酮的工藝參數(shù)考察

2.2.1 不同上樣流速對AB-8 大孔吸附樹脂吸附效果的影響

取3 BV 芡實葉黃酮類物質(zhì)提取液（黃酮類物質(zhì)濃度為3.6 mg/mL），調(diào)節(jié)pH5，分別以1、2、3 BV/h 的上樣流速進(jìn)行比較實驗，見圖2。

圖2 不同上樣流速對AB-8 大孔吸附樹脂吸附效果的影響Fig.2 The effect of different adsorption velocity on the adsorption impact of AB-8 resin

由圖2 可以看出，吸附流速為1 BV/h 和2 BV/h時，泄漏點（泄漏點是指該處漏出液黃酮類物質(zhì)的濃度為上柱前樣液黃酮類物質(zhì)濃度的1/10，本實驗泄漏點在Y 軸上對應(yīng)0.36 mg/mL）出現(xiàn)較晚；流速為3 BV/h時泄漏點出現(xiàn)最早。流速1、2、3 BV/h 的泄漏點分別出現(xiàn)在82、65、58 mL 附近。上樣液通過樹脂柱的速度越慢，黃酮類物質(zhì)越易與大孔吸附樹脂充分接觸，從而提高吸附效果，但隨著吸附流速的加大，泄漏點出現(xiàn)提早，吸附效率隨之降低，這是因為流速過快時，大孔吸附樹脂還未來得及吸附黃酮類物質(zhì)，黃酮類物質(zhì)已隨吸附液流出。但是過慢的流速也會降低吸附效率，因為大孔吸附樹脂是一種表面吸附劑，其吸附力與樹脂的比表面積、表面電性、能否與被吸附物形成氫鍵等有關(guān)[5]，如果流速過慢則被吸附物質(zhì)與樹脂之間的作用力會發(fā)生變化，影響吸附效果。本實驗綜合考慮工業(yè)化生產(chǎn)成本等因素建議上樣流速選用2 BV/h。

2.2.2 不同上樣液pH 對AB-8 大孔吸附樹脂吸附效果的影響

取3 BV 芡實葉黃酮類物質(zhì)提取液，以2 BV/h 的吸附流速上樣，選擇pH 為4、5、6、7 進(jìn)行比較實驗，見圖3。

圖3 上樣液pH 值對AB-8 大孔吸附樹脂吸附效果的影響Fig.3 The effect of different initial solution ph value on the adsorption impact of AB-8 resin

由圖3 可以看出，pH 分別為4、5、6、7 的上樣液經(jīng)過樹脂柱，泄漏點分別在75、83、80、63 mL 附近（泄漏點在Y 軸上對應(yīng)0.36 mg/mL）。因為芡實葉黃酮類物質(zhì)有多酚結(jié)構(gòu)，具有較多的羥基，呈弱酸性，故在酸性或弱酸性條件下易被吸附，但酸性較強時黃酮分子易形成“佯鹽”，偏堿性時黃酮分子羥基H+離去，黃酮類物質(zhì)形成離子結(jié)構(gòu)，且有沉淀物生成，故而都不易被吸附[6]，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH 值為5.0 時吸附效果較佳。

2.3 AB-8 大孔吸附樹脂對芡實葉黃酮的動態(tài)解吸實驗

圖4 乙醇濃度對AB-8 大孔吸附樹脂解吸效果的影響Fig.4 The effect of different alcohol concentration on the desorption of resin

2.3.1 不同濃度乙醇對芡實葉黃酮的洗脫效果的影響

選擇3 BV 乙醇溶液對吸附過芡實葉黃酮的樹脂柱進(jìn)行解吸處理，解吸流速為1BV/h，比較乙醇濃度為10%、30%、50%、60%、80%、90%時的解吸效果，解吸率如圖4 所示：隨著乙醇濃度的增高，芡實葉黃酮類物質(zhì)的解吸率不斷上升，這一規(guī)律與李鳳林利用AB-8 大孔吸附樹脂純化甘薯葉黃酮實驗結(jié)果一致[7]，乙醇濃度達(dá)到80 %后解吸效果上升不明顯，AB-8 大孔吸附樹脂為弱極性的樹脂，其吸附的黃酮類物質(zhì)極性較小，故乙醇濃度越高即極性越小則洗脫效果越明顯[8]?？紤]到乙醇濃度增大到一定程度后，解吸率提高不明顯，而大量雜質(zhì)也會隨之洗脫下來，這將使芡實葉黃酮純度下降；綜合考慮，解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇80%。

2.3.2 不同洗脫體積對芡實葉黃酮的洗脫效果的影響

選擇80%的乙醇溶液做為洗脫劑對吸附過芡實葉黃酮的樹脂柱進(jìn)行解吸處理，解吸流速為1 BV/h，比較洗脫體積為2、3、4、5 BV 時的解吸率，見圖5。

圖5 乙醇洗脫體積對AB-8 大孔吸附樹脂解吸率的影響Fig.5 The effect of different alcohol elution volume on the desorption of resin

由圖5 可知：在起始階段，隨著洗脫體積的增大，黃酮類物質(zhì)的解吸率增加很快，當(dāng)洗脫體積達(dá)3 BV后，解吸率隨洗脫體積的增加無明顯變化，說明已基本達(dá)到解吸平衡。洗脫劑最佳用量的確定，原則是在充分解吸所吸附的物質(zhì)的前提下，盡量節(jié)省解吸劑的用量，因此選定3 BV 作為洗脫體積。

2.3.3 不同解吸流速對芡實葉黃酮的洗脫效果的影響

采用3 BV 的80%乙醇溶液對吸附過芡實葉黃酮的樹脂柱進(jìn)行解吸，比較解吸流速為0.5、1、1.5 BV/h時的解吸率，間隔10 mL 收集漏出液測定黃酮類物質(zhì)濃度，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 不同解吸流速對AB-8 大孔吸附樹脂解吸效果的影響Fig.6 The effect of different desorption velocity on desorption performance

解吸流速為0.5 BV/h 時，峰形寬，峰值低，且拖尾現(xiàn)象很嚴(yán)重；解吸流速為1 BV/h 時，解吸較快而且峰值最高，其從峰形、峰值及拖尾現(xiàn)象來看，都與解吸流速為1.5 BV/h 相差不大。解吸流速過快時，解吸性能差，解吸帶寬，且拖尾嚴(yán)重，解吸不完全，流速過慢，會延長生產(chǎn)周期。本實驗顯示解吸流速為1 BV/h 效果最佳。

2.4 芡實葉黃酮類物質(zhì)純度測定結(jié)果

按純度測定方法，經(jīng)計算在芡實葉黃酮提取液中，黃酮純度為18%；通過AB-8 大孔吸附樹脂最佳純化工藝（上樣流速2 BV/h，上樣pH=5.0，以80 %濃度乙醇作為洗脫劑，洗脫體積3 BV，解吸流速1 BV/h）精制后黃酮純度提高到76.5%，是原來的4.25 倍。

3 結(jié)論

通過比較AB-8、D101、HPD100、HZ801 4 種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附性能發(fā)現(xiàn)AB-8 大孔吸附樹脂對芡實葉黃酮具有良好的吸附性能，用以純化芡實葉黃酮是可行的。

AB-8 大孔吸附樹脂純化芡實葉黃酮的最佳工藝條件為：上樣流速2 BV/h，上樣液pH5.0，以體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇進(jìn)行解吸，洗脫體積3 BV，解吸流速1 BV/h時，純度測定結(jié)果表明，經(jīng)AB-8 樹脂純化后芡實葉黃酮純度為76.5%。

本方法簡單易行，成本低廉，安全可靠，提取的黃酮可作為藥用或開發(fā)保健食品；利用大孔樹脂具有穩(wěn)定性高，吸附容量大，選擇性好，吸附速度快，再生處理方便，使用周期長等優(yōu)點，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

[1] 張然,賀芳,崔竹梅,等.芡實葉黃酮超聲提取工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué),2011,32(22):42-45

[2] S Martens,A Mith?fer A.Flavones and flavone synthases[J].Phytochemistry,2005,66:2399-2407

[3] CookN C,Samman S.Flavonoids-chemistry,metabolism,cardioprotective effects,and dietary sources[J].NutrBiochem,1996,7:66

[4] B Halliwell,JMC Gutteridge.Free Radicals in Biology and Medicine[M].New York:Oxford University Press Inc,1999:225-227

[5] 周桃英,羅登宏,李國慶, 等.AB-8 大孔樹脂純化荷葉總黃酮的工藝研究[J].中國食品添加劑,2009(5):113-119

[6] 楊培民,代龍,魏永利.大孔吸附樹脂分離純化白花蛇舌草總黃酮的研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2010,33(6):417-424

[7] 李鳳林,李青旺.大孔樹脂純化甘薯葉黃酮的工藝研究[J].中國食品添加劑,2009(4):103-108

[8] 黃月純,黃櫻華,劉翠玲,等.大孔吸附樹脂純化側(cè)柏葉總黃酮的工藝研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2010,21(1):75-80