李晶，趙海燕，李鯤鵬

1. 成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院 設(shè)備科，云南昆明 650032；2.云南省第一人民醫(yī)院眼科，云南 昆明 650032；3.中山大學(xué)生物防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州510275

近年來，病毒的傳播和變異使人類的生命健康受到威脅，甚至造成社會(huì)的動(dòng)蕩不安。解析病毒的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)疾病的防治及抗病毒藥物的開發(fā)有重要意義。病毒是最簡(jiǎn)單的生物系統(tǒng)，它具有生命體的某些特性，如具有基因組，能繁殖、進(jìn)化、適應(yīng)環(huán)境改變等。自從1892年伊凡諾夫斯基第一次發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒（TMV）以來，對(duì)病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)研究就一直是病毒學(xué)研究的主要課題。病毒結(jié)構(gòu)多種多樣，本項(xiàng)目側(cè)重研究與人類疾病有關(guān)的二十面體對(duì)稱型病毒。該病毒的功能與其特定的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，尤其是與活性區(qū)域的結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系。大部分病毒由蛋白衣殼以及核酸組成。病毒衣殼基因主要作用就是作為合成衣殼蛋白的模板。衣殼蛋白對(duì)病毒的復(fù)制起重要作用。因此，測(cè)定解析病毒蛋白衣殼結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)蛋白的運(yùn)動(dòng)變化，可以從根本上了解病毒結(jié)構(gòu)從而控制病毒。

1 研究現(xiàn)狀

分子模擬是另外一項(xiàng)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的技術(shù)。分子模擬是以實(shí)驗(yàn)測(cè)試的結(jié)構(gòu)為模板，建立原子水平的模擬模型，再根據(jù)原子分子物理化學(xué)原理，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。模擬模型和運(yùn)算原理由力場(chǎng)和算法來體現(xiàn)。力場(chǎng)是模型的體現(xiàn)，算法體現(xiàn)所運(yùn)用的物理化學(xué)原理核心是“能量最低狀態(tài)”。而利用分子模擬技術(shù)，結(jié)合計(jì)算機(jī)圖形技術(shù)可以更形象、更直觀地研究蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)。分子模擬能夠在實(shí)驗(yàn)測(cè)定的基礎(chǔ)上，更加精細(xì)的解析蛋白分子動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，繼而更改及設(shè)計(jì)出性能符合人們要求的新結(jié)構(gòu)，其重要意義是不言而喻的。在國外它一直是個(gè)研究熱點(diǎn)，主要集中于對(duì)模擬模型的建立和算法的優(yōu)化研究上[1]。模擬模型試圖不斷地接近真實(shí)的原子結(jié)構(gòu)[2]，出現(xiàn)了MM系列力場(chǎng)、AMBER力場(chǎng)、CHARMm力場(chǎng)以及第二代力場(chǎng)。算法方面的研究主要側(cè)重對(duì)經(jīng)典算法的改進(jìn)提高[3]。核心算法還是圍繞量子力學(xué)方法、分子力學(xué)法、蒙特卡洛法、分子動(dòng)力學(xué)等方法。其中，分子動(dòng)力學(xué)能研究體系中與時(shí)間和溫度有關(guān)的性質(zhì)，對(duì)動(dòng)態(tài)特性的研究更顯優(yōu)勢(shì)。還有一些直接由一級(jí)結(jié)構(gòu)直接預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的純計(jì)算方法包括遺傳算法[4]、模擬退火[5]、多維統(tǒng)計(jì)[6]、模糊集合論方法[7]等。這些模型和方法都存在實(shí)用方面的局限以及預(yù)測(cè)精度欠佳等問題[8-10]。國內(nèi)分子模擬的研究相對(duì)于國外起步較晚，分子模擬多為直接應(yīng)用軟件Insight II和Quanta等來進(jìn)行?，F(xiàn)有的研究中，以電鏡為基礎(chǔ)進(jìn)行的預(yù)測(cè)，多為用單純的電鏡結(jié)構(gòu)與分子模擬結(jié)構(gòu)擬和進(jìn)行比對(duì)來對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。而把電鏡結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)作為邊界條件，加之一定力場(chǎng)，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)方法所進(jìn)行的分子模擬計(jì)算，未見相關(guān)報(bào)道。

綜合上述各種方法的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)可知：利用電鏡對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的解析有分辨率在逐步提高，并適用范圍逐步擴(kuò)大。由于分辨率的限制，電鏡對(duì)蛋白分子結(jié)構(gòu)的解析，只能比喻為一張對(duì)蛋白分子結(jié)構(gòu)輪廓的靜態(tài)照片。若加之分子模擬技術(shù)則可以描述出分子結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)圖像。進(jìn)而描述蛋白分子結(jié)構(gòu)的行為和變化。這種技術(shù)對(duì)揭示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系、總結(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的規(guī)律、預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)肽鏈折疊和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等，都是有力的促進(jìn)。因此，本項(xiàng)目提出以電鏡結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的分子模擬研究，就是以電鏡結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)作為邊界條件，參與分子模擬的計(jì)算。分子模擬使用CHARMm力場(chǎng)，應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)方法進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)的解析預(yù)測(cè)，最終用三維圖像顯示技術(shù)，將蛋白序列與電鏡結(jié)構(gòu)擬和顯示出來。

2 研究方法

2.1 本項(xiàng)目的基本思路

用電子顯微學(xué)方法得到病毒的三維結(jié)構(gòu)密度圖，進(jìn)行局部分割顯示，尤其是對(duì)功能域進(jìn)行局部的分割、控制與計(jì)算，得到病毒的外圍結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。以此為邊界條件，結(jié)合分子生物學(xué)對(duì)序列的測(cè)定，使用CHARMm力場(chǎng)，應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)方法進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)的解析預(yù)測(cè)。再用三維圖像顯示技術(shù)對(duì)各個(gè)部分所得結(jié)構(gòu)進(jìn)行嵌和顯示。

2.2 研究目的

目的在于解析蛋白分子空間結(jié)構(gòu)，了解它的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，為病毒的防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2.3 數(shù)據(jù)獲取

用單顆粒技術(shù)方法研究的樣品包括：濃核病毒、家蠶質(zhì)多角體病毒、中鋒囊狀病毒。對(duì)它們進(jìn)行電鏡三維重建，得到三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的分辨率分別為：1.4 nm、2.5 nm、2.5 nm（前期的研究已經(jīng)獲得該項(xiàng)數(shù)據(jù)）。

2.4 數(shù)據(jù)處理

（1）將病毒進(jìn)行任意區(qū)域的分割、控制及形態(tài)計(jì)算。

（2）用分子動(dòng)力學(xué)中混合蒙特卡羅模擬方法，建立蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)學(xué)模型。將分割后的病毒形態(tài)作為邊界約束，采用形態(tài)匹配，預(yù)測(cè)病毒功能結(jié)構(gòu)域空間分布，獲得每個(gè)任意局部和氨基酸序列的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

（3）統(tǒng)一結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，將病毒的X射線晶體衍射三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與冷凍電鏡三維重構(gòu)的電子云密度圖進(jìn)行擬和。

（4）比較分子模擬與晶體衍射結(jié)構(gòu)，以驗(yàn)證方法和算法的正確性。

3 結(jié)束語

本項(xiàng)目選擇材料有濃核病毒、登革病毒、家蠶質(zhì)多角體病毒、中鋒囊狀病毒作為研究材料，重點(diǎn)以家蠶質(zhì)多角體病毒衣殼蛋白VP3實(shí)例進(jìn)行分子模擬預(yù)測(cè)。本項(xiàng)目綜合國內(nèi)外的研究狀況，結(jié)合自身的研究基礎(chǔ)，基于病毒重建三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，進(jìn)行計(jì)算機(jī)分子模擬。這個(gè)方面的研究在世界范圍內(nèi)也是近幾年才起步的，而基于電子顯微學(xué)方法進(jìn)行病毒的三維重建，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)方法所進(jìn)行的分子模擬研究，尚未見報(bào)道。如獲得經(jīng)費(fèi)資助，經(jīng)過努力，可以在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立基于電鏡數(shù)據(jù)的分子模擬，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒等大分子蛋白復(fù)合物二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，在分子水平上對(duì)蛋白質(zhì)任意局部分割，量化計(jì)算，控制改變?nèi)我饩植康目臻g位置，為疾病的防治和藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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