張永晟 陳 健 何劍全 (廈門大學(xué)，福建 廈門 36000)

超聲被廣泛應(yīng)用于臨床的診斷和治療，但是臨床上低頻脈沖超聲(LIPU)的應(yīng)用卻非常有限。在實驗中，LIPU的應(yīng)用卻是很廣泛。在許多的動物實驗中證實，LIPU對許多結(jié)締組織疾病有一定療效。

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是以關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、軟骨下骨等合成與分解代謝失衡，關(guān)節(jié)軟骨損壞為特征的全關(guān)節(jié)疾病。OA是臨床上最常見的一類關(guān)節(jié)疾病，已成為老年人致殘的一個主要原因，據(jù)初步調(diào)查我國OA的發(fā)病率隨著增齡而增加，40歲以上人群骨關(guān)節(jié)炎患病率為27.8%，70歲以上為46.6%〔1〕。美國的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，OA是導(dǎo)致50歲以上男性喪失工作能力的第2號殺手，僅次于心血管疾病〔2〕。隨著我國老齡化加速，OA已經(jīng)成為醫(yī)患及社會關(guān)心的焦點。透明軟骨是一種特殊組織，透明軟骨中包含大量的水分、致密的細(xì)胞外基質(zhì)以及包被在其中的軟骨細(xì)胞。在透明軟骨中，沒有血管，軟骨細(xì)胞所需要的營養(yǎng)全靠周圍的滑液來供給。軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，維持基質(zhì)的完整。關(guān)節(jié)軟骨的退變是整個退變過程的始動因素，是整個疾病發(fā)生過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔3，4〕。透明軟骨的生物學(xué)作用取決與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)及構(gòu)成，細(xì)胞外基質(zhì)占總重量的90%，主要由Ⅱ型膠原、蛋白多糖及水構(gòu)成。正是由于這種特殊的結(jié)構(gòu)，妨礙了透明軟骨的修復(fù)，加速了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，低頻脈沖超聲具有提高細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)的合成，改變細(xì)胞膜的滲透率以及對骨科某些疾病也有一定的作用，因此提出LIPU可能是一種治療軟骨病損的新方法。基于LIPU能夠?qū)顷P(guān)節(jié)炎進(jìn)展中的軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)代謝產(chǎn)生各種影響，因此筆者從軟骨細(xì)胞及基質(zhì)代謝作一綜述。

1 LIPU對軟骨細(xì)胞生長、增殖的影響

以往的研究表明，在動物模型中LIPU對軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用，并且能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的修復(fù)。但是，軟骨細(xì)胞的生存也受到其他因素的影響，比如細(xì)胞的繁殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的生成。軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)主要有兩種方法，分別是單層培養(yǎng)和模擬體內(nèi)生長環(huán)境的3D模式培養(yǎng)。根據(jù)不同的體外細(xì)胞培養(yǎng)方式進(jìn)行了研究，但是由于LIPU所涉及的參數(shù)較多，如強度、頻率、作用時間及脈沖比等，所得的結(jié)果不同，甚至是相反的。有些實驗結(jié)果表明，LIPU能夠極大促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成以及增加蛋白多糖(PG)的比值。同時，也有實驗結(jié)果卻得出了相反的結(jié)論，指出LIPU對軟骨細(xì)胞毫無作用。Boopalan等〔5〕的實驗中，用新西蘭兔作為實驗對象，分為實驗組和對照組。實驗組經(jīng)過LIPU頻率為1Hz，電壓為20 V，電流為±30 mA，每天1 h處理6 w后，發(fā)現(xiàn)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)量比對照組數(shù)量明顯增加。而在Schmidt-Rohlfing等〔6〕的實驗中得出的結(jié)果是LIPU對軟骨細(xì)胞沒有作用。

在體內(nèi)實驗中，Dunkin Hartley豚鼠是很好的骨關(guān)節(jié)炎動物模型。這種豚鼠能夠自發(fā)產(chǎn)生骨關(guān)節(jié)炎，在組織學(xué)上，3個月就能在脛骨平臺上觀察到組織學(xué)上的改變，并且在今后的9個月，軟骨的退行性改變能夠一直進(jìn)展下去，所以該豚鼠是很好的骨關(guān)節(jié)炎模型。通過LIPU對患有骨關(guān)節(jié)炎豚鼠的治療，Ciomboretal等〔7〕的實驗結(jié)果表明，經(jīng)過LIPU治療的豚鼠，軟骨組織的厚度明顯高于非治療組。LIPU對軟骨細(xì)胞增殖的作用機(jī)制可能存在以下方面:磁場直接作用于細(xì)胞膜改變跨膜點位，引起其離子通道活性改變，致使Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加激活細(xì)胞內(nèi)其他信號通路〔8〕;增加細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP的濃度，由于磁場引起細(xì)胞跨膜電位改變從而引起細(xì)胞內(nèi)部分離子濃度的改變，觸發(fā)cAMP-蛋白激酶A信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，引起細(xì)胞功能的改變〔8〕;在磁場洛侖茨力的作用下，細(xì)胞核內(nèi)帶電的氫離子運動軌跡發(fā)生改變，部分氫離子可在不同的堿基對之間轉(zhuǎn)移，進(jìn)而使DNA中某些位置的堿基序列發(fā)生，從而改變細(xì)胞內(nèi)某些基因的表達(dá)水平〔9〕。通過體內(nèi)、體外實驗的研究表明，LIPU在一定的強度、頻率、處理時間下對軟骨細(xì)胞有保護(hù)作用，并能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。

2 LIPU對軟骨細(xì)胞凋亡的影響

骨關(guān)節(jié)炎作為一種退行性病變，軟骨細(xì)胞的代謝起到了重要的作用。在生理情況下，軟骨細(xì)胞的分解代謝和合成代謝處于平衡狀態(tài)，維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的完整性，而軟骨細(xì)胞凋亡既可以維持這種平衡，也可以破壞這種平衡。Hashimoto等〔10〕用流式細(xì)胞技術(shù)檢測到OA軟骨細(xì)胞22.3%發(fā)生凋亡，而正常軟骨細(xì)胞為4.8%。Héraud等〔11〕采用熒光激活細(xì)胞分類法(FACS)、原位雜交及脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)等方法觀察人正常和OA股骨頭關(guān)節(jié)軟骨，發(fā)現(xiàn)OA患者中有18% ～21%軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡特征，而正常關(guān)節(jié)軟骨中只有2%～5%凋亡細(xì)胞。國內(nèi)學(xué)者秦泗通等〔12〕通過對大鼠行單側(cè)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切除術(shù)(ACLT)造模后與正常組比較，凋亡指數(shù)分別為(11.31±1.34)%和(1.48±0.38)%。綜上所述，盡管軟骨細(xì)胞的凋亡比例各家報道略有差別(差異可能與檢測方法或?qū)嶒瀸ο蟛煌嘘P(guān))，但均證實了OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡高于正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。因此，闡明骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中軟骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制對于骨關(guān)節(jié)炎的防治有重要意義。與一般細(xì)胞凋亡相比，OA軟骨細(xì)胞凋亡有其獨特性:①將關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)泡分離出來連同正常的軟骨細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞誘生的凋亡小體進(jìn)行三磷酸核苷酸磷酸脫氫酶(NTPPH)的活性檢測，發(fā)現(xiàn)NTPPH在軟骨細(xì)胞間隙內(nèi)或軟骨基質(zhì)間凋亡小體內(nèi)的活性明顯升高，由于NTPPH與鈣化沉積和骨的鈣化有關(guān)，因此凋亡小體可能有加速關(guān)節(jié)軟骨鈣化的功能〔13〕;②由于關(guān)節(jié)軟骨中無血管分布，當(dāng)軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡時，凋亡小體無法被巨噬細(xì)胞帶走而滯留在關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)，影響關(guān)節(jié)軟骨正常生理功能，只有當(dāng)軟骨基質(zhì)發(fā)生降解，凋亡小體才有可能被釋放到關(guān)節(jié)間隙中而被清除;③軟骨細(xì)胞凋亡與基質(zhì)降解密切相關(guān)〔14〕，當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞過度凋亡時，由軟骨細(xì)胞合成的基質(zhì)減少，破壞其生存環(huán)境，形成惡性循環(huán)?，F(xiàn)在對軟骨細(xì)胞的凋亡研究都集中在凋亡途徑上。軟骨細(xì)胞的凋亡主要有NO和Fas兩種途徑介導(dǎo)，是由Hashimoto最先闡明的。另外軟骨細(xì)胞的凋亡也與原癌基因的表達(dá)有關(guān)，軟骨細(xì)胞的存活依賴于癌基因之間的平衡，Bcl22基因家族、P53基因、ICE基因家族、c-myc基因等均可調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡途徑，其中Bcl22基因家族和P53基因研究較為深入。通過對凋亡過程中胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與級聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵步驟的研究深入，利用藥物切斷其信號傳導(dǎo)途徑抑制軟骨細(xì)胞凋亡，已成為目前的研究重點。

3 LIPU對軟骨細(xì)胞基質(zhì)的影響

軟骨細(xì)胞被包被在細(xì)胞基質(zhì)當(dāng)中，這就構(gòu)成了軟骨細(xì)胞中的微環(huán)境。因此，軟骨中細(xì)胞基質(zhì)的多少直接影響了軟骨細(xì)胞的功能。關(guān)節(jié)軟骨中的基質(zhì)蛋白合成和分解平衡是維系正常關(guān)節(jié)功能的重要因素。其中，蛋白多糖和Ⅱ型膠原是關(guān)節(jié)軟骨的兩種重要成分。兩種成分的減少在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中顯得異常重要〔15，16〕。因此，也有大量研究集中于Ⅱ型膠原、蛋白多糖的合成代謝等〔17～19〕。在許多動物實驗和體外細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，LIPU能夠增加蛋白多糖和Ⅱ型膠原的表達(dá)。在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，筆者通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，LIUS能夠增加基質(zhì)蛋白的表達(dá)水平，但是由于受到外部條件的影響，基質(zhì)蛋白的表達(dá)并不是很穩(wěn)定。在人關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)中，經(jīng)過200 mW/cm2LIUS的作用下，基質(zhì)蛋白的合成有明顯的增加〔18〕。在一些實驗中，通過免疫組化分析也能夠發(fā)現(xiàn)蛋白多糖和Ⅱ型膠原在一些特定的部位有明顯的增加。在De Mattei等〔20〕的實驗中，不同頻率的LIPU均對蛋白多糖的表達(dá)有不同程度的增加。另外，金屬蛋白酶(MMPs)和金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)在骨關(guān)節(jié)炎中也扮演著重要的角色。二者的平衡在骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展中也起到了重要的作用。因此，改變金屬蛋白酶和金屬蛋白酶抑制劑的平衡也就成為了骨關(guān)節(jié)炎治療的一條重要途徑。在 BYoung-Hyun等〔21〕的實驗中，LIPU抑制了MMP1的表達(dá)，同時TIMP-2的表達(dá)增加。在 Ito等〔22〕的實驗中，在不同強度的LIPU作用下，MMP1和MMP13的mRNA表達(dá)都有所增加。以上研究都表明了LIPU能夠減少關(guān)節(jié)軟骨中基質(zhì)蛋白的丟失以及增加基質(zhì)的完整性。

4 總結(jié)

LIPU在低強度的磁場(0.1 W/cm2)能夠促進(jìn)組織的修復(fù)〔23〕，并被應(yīng)用于臨床〔24〕，作為一種無創(chuàng)的治療方法，LIPU 對軟骨細(xì)胞及其基質(zhì)具正向調(diào)節(jié)作用潛能。近年來研究表明，LIPU有利于提高軟骨細(xì)胞修復(fù)后的組織學(xué)質(zhì)量，一定強度、一定條件下的LIPU對軟骨細(xì)胞活性無影響并促進(jìn)細(xì)胞分泌基質(zhì)等，LIPU可能是一種治療軟骨病損的新方法，為關(guān)節(jié)軟骨病損的無創(chuàng)修復(fù)帶來新的希望。LIPU能夠影響軟骨細(xì)胞的生長、繁殖及凋亡，影響細(xì)胞外基質(zhì)的代謝，但是由于磁場的生物學(xué)效應(yīng)復(fù)雜且受到場強、磁場頻率和刺激時間的共同影響〔25，26〕，尋找安全有效的磁場參數(shù)，深入探究其機(jī)制，還有待進(jìn)一步的研究。

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