張卓然，張珊珊，曾健勇，張國(guó)財(cái)

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北蟲草、北冬蟲夏草。屬于子囊菌亞門（Ascomycotina），麥角菌科（Clavicipitaceae），蟲草屬（Cordyceps）。其主要化學(xué)成分和藥理作用與冬蟲夏草相似［1－2］，對(duì)哮喘及支氣管疾病、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)腎衰竭病人的腎功能等方面都有很好的治療效果［3－5］，是冬蟲夏草最理想的代用品［6］。而蛹蟲草在全世界的天然資源量較少，天然資源遠(yuǎn)不能滿足大眾需求。近年來(lái)，蛹蟲草的人工栽培技術(shù)發(fā)展迅速［7］。目前，蛹蟲草研究人員已在蛹蟲草人工栽培、化學(xué)成分、藥理、開發(fā)應(yīng)用等方面做了廣泛的研究，取得了一些成果［8］。然而在我國(guó)北方地區(qū)人工栽培蛹蟲草未見報(bào)道。因此，本文通過(guò)對(duì)蛹蟲草現(xiàn)有人工栽培方法的篩選，結(jié)合適宜北方培養(yǎng)的蛹蟲草生長(zhǎng)特性觀察，得出適于北方地區(qū)栽培的原種菌絲培養(yǎng)、栽培種制作及罐裝培養(yǎng)的條件。

1 生長(zhǎng)特性

蛹蟲草（Cordyceps militaris）形態(tài)特征：子座單生或數(shù)個(gè)一起從寄生蛹體的頭部或節(jié)部長(zhǎng)出，顏色為橘黃或橘紅色，全長(zhǎng)2～8cm，蛹體顏色為紫色，長(zhǎng)約1.5～2cm［9］。在蟲草的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段都有最適溫度、最低溫度和最高溫度的界限［10－11］。菌絲生長(zhǎng)溫度6～30℃，低于6℃極少生長(zhǎng)，高于30℃停止生長(zhǎng)，甚至死亡。最適生長(zhǎng)溫度為18～22℃［12－14］。

2 母種選擇

蛹蟲草（Cordyceps militaris）菌種：來(lái)自黑龍江省綏化市望奎縣北蟲草生產(chǎn)基地。

3 原種的制作

3.1 培養(yǎng)基配方

土豆200g／L，葡萄糖20g／L，蛋白胨3g／L，KH2PO42g／L，MgSO41g／L，VB10.05g／L，檸檬酸三銨1g／L，瓊脂20g／L。

3.2 制作方法

馬鈴薯去皮洗凈，切成1cm見方小塊，沸水熬煮20min，過(guò)濾取汁。濾液中加入葡萄糖﹑瓊脂等其他輔料，繼續(xù)加熱攪拌至藥品完全溶解后用試管分裝，每支試管裝至容量的五分之一處即可，膠塞封口，121℃高壓蒸汽滅菌20min，取出后斜置冷卻。

在無(wú)菌環(huán)境下將母種接至斜面培養(yǎng)基中，避光，19℃條件下培養(yǎng)。至菌絲長(zhǎng)滿斜面給予散色光照，轉(zhuǎn)色完成后可做原種，用于接種。

4 液體發(fā)酵

4.1 培養(yǎng)基制作及接種：

培養(yǎng)基成分：土豆200g／L，葡萄糖20g／L，蛋白胨3g／L，KH2PO42g／L，MgSO41g／L，VB10.05g／L，檸檬酸三銨1g／L。

培養(yǎng)基的制作過(guò)程同3.2（輔料中無(wú)瓊脂），裝瓶，每個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基為100mL，接種時(shí)在超凈工作臺(tái)內(nèi)按無(wú)菌操作的要求。選用離最外圍菌苔2～3cm的母種，從試管斜面中切取0.5cm×0.5cm左右的菌絲塊1塊，在酒精燈火焰區(qū)內(nèi)快速放到錐形瓶液體培養(yǎng)基中。

4.2 培養(yǎng)過(guò)程

接種后置于22℃恒溫培養(yǎng)箱中先避光靜置培養(yǎng)1d，初步觀察液體培養(yǎng)基有無(wú)污染及菌絲塊是否萌發(fā)，再移至恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)，將轉(zhuǎn)速調(diào)到120r／min左右，在19℃下經(jīng)5d震蕩培養(yǎng)后可以看到直徑0.5～2.0mm的菌絲球均勻布滿透明的橙黃色的營(yíng)養(yǎng)液。

5 栽培方法

5.1 培養(yǎng)基配方

小麥30g／罐，液體培養(yǎng)基50mL／罐。液體培養(yǎng)基成分：土豆200g／L，葡萄糖20g／L，蛋白胨10g／L，KH2PO42g／L，MgSO41g／L，VB10.05g／L，檸檬酸三銨1g。

5.2 接種

液體菌種處理：液體發(fā)酵所得的液體菌種應(yīng)用無(wú)菌水稀釋至其自身的4～5倍，搖勻，用于接種。

培養(yǎng)基滅菌：將用罐頭瓶裝好的小麥培養(yǎng)基置于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌40～60min。取出冷卻后，移入接種室。滅菌后的培養(yǎng)基以上下表面濕度基本一致，麥粒之間具有一定的空隙，不粘稠成糊狀，麥粒多開裂為優(yōu)。

消毒：接種工具、菌種外壁、操作人員雙手等，用75%酒精擦拭或浸沾消毒。接種前用優(yōu)質(zhì)氣霧消毒劑或常規(guī)方法對(duì)接種室密閉消毒30min，即可穿戴消毒衣服進(jìn)入接種室接種。

接種：當(dāng)培養(yǎng)基冷卻到30℃以下時(shí)，在超凈工作臺(tái)的無(wú)菌環(huán)境下接種。每瓶接種液體菌種5mL。接種時(shí)應(yīng)從菌球和清液交界處吸取液體菌種，可避免各瓶接種量不均的情況。另外為了菌絲加快生長(zhǎng)，迅速占領(lǐng)料面，可適當(dāng)?shù)脑黾咏臃N量，并盡可能地將菌種均勻?yàn)⒉剂厦妗?/p>

5.3 培養(yǎng)過(guò)程

接種后栽培瓶應(yīng)直立放置、避光培養(yǎng)1～2d，待菌絲萌發(fā)、定植后再上架培養(yǎng)，否則菌液及培養(yǎng)基會(huì)倒向一側(cè)，導(dǎo)致出草不齊。發(fā)菌前期溫度為22℃，空氣相對(duì)濕度65%左右，避光培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)基料面布滿菌絲后，將溫度提高到25℃，持續(xù)15～20d，菌絲就可吃透培養(yǎng)料，完成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基料面菌絲濃密，菌絲穿透并長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，氣生菌絲表面出現(xiàn)一些小隆起時(shí)，表明菌絲生理成熟，此時(shí)需要增加光照，促進(jìn)轉(zhuǎn)色。轉(zhuǎn)色溫度控制在22℃為宜，空氣相對(duì)75%左右，給予一定的散色光或用日光燈照射采光，保持良好的通氣條件，繼續(xù)培養(yǎng)5～7d，菌絲體由白色逐漸轉(zhuǎn)為黃色或橘黃色。轉(zhuǎn)色完成后原基形成前，用木片或其他能形成平面的器具刮去培養(yǎng)基表面的氣生菌絲［15］。當(dāng)菌絲轉(zhuǎn)為橘黃色后，加大光照強(qiáng)度，轉(zhuǎn)色時(shí)一般給予1H／d以上的光照刺激，同時(shí)進(jìn)行晝夜溫差刺激10℃左右，可將白天溫度控制在20～22℃，晚上控制在10～12℃，相對(duì)濕度為75%，保持良好的通氣條件，以刺激子實(shí)體原基的分化。一般10d左右培養(yǎng)基表面出現(xiàn)原基突起并轉(zhuǎn)為橘黃色。出草是由小米粒狀原基逐漸長(zhǎng)為成熟草的過(guò)程。此期間是提高產(chǎn)量的關(guān)鍵期，應(yīng)加強(qiáng)通風(fēng)，補(bǔ)充新鮮空氣，室內(nèi)每天通風(fēng)1次，前期1h／次，后期出草量大，呼吸增強(qiáng)，通風(fēng)時(shí)間延長(zhǎng)；保持室內(nèi)溫度在23℃；空氣相對(duì)濕度提高至85%～90%。由于蛹蟲草具有較強(qiáng)的趨光性，在子實(shí)體形成后，應(yīng)根據(jù)生長(zhǎng)情況，調(diào)整培養(yǎng)瓶與光源的相對(duì)方向，或調(diào)整室內(nèi)光源方向，以保證子實(shí)體的正常生長(zhǎng)形態(tài)，提高產(chǎn)量。

6 采收及保存

從接種到子實(shí)體生長(zhǎng)成熟需45～60d，當(dāng)子實(shí)體高度近接觸封口處聚丙烯薄膜或上部有黃色突起物出現(xiàn)時(shí)，整個(gè)子座呈橘紅色或橘黃色并且頭部出現(xiàn)龜裂狀花紋，表面出現(xiàn)孢子粉菌，此時(shí)菌絲體不再生長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)及時(shí)采收。

采收時(shí)用長(zhǎng)柄鑷子，把子實(shí)體從基部切下。將根部整理干凈后，分等級(jí)晾曬，晾曬過(guò)程中應(yīng)避免子實(shí)體在陽(yáng)光下曝曬，以保持其鮮艷的橘紅色。晾曬至5～6成干后，再置于烘箱或微波爐中40～50℃條件下烘干。烘干后可用適量的黃酒噴霧噴霧回軟，整理平直后后捆扎成小捆裝袋密封置于干燥處保存［7］。

［1］李祝，劉愛英，梁宗琦.蟲草菌素的生物活性及檢測(cè)方法［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2002，9（1）：57－62.

［2］張平，朱述均，錢大順，等.北冬蟲夏草功能成分及保健作用分析［J］.江西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（6）：105－107.

［3］陳千良，甘志杰，孫文基.HPLC法測(cè)定人工蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素［J］.西北大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，10（5）：569－571.

［4］郭澄，朱杰，張銳，等.高效液相色譜法測(cè)定人工蟲草菌絲中腺苷和蟲草素含量［J］.中國(guó)中藥雜志，1998，23（4）：632－633.

［5］傅嵐，陳作紅.蟲草屬真菌化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)研究，2004，8（1）：1－7.

［6］張紅霞，吳畏，陳偉，等.北冬蟲夏草發(fā)酵液中蟲草素和腺苷含量的HPLC分析［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，21（4）：53－56.

［7］古恒生，梁漫逸.人工培育蛹蟲草研究［J］.藥學(xué)情報(bào)通訊 ，1987 ，5（3）：51－53.

［8］王建芳，楊春清.蛹蟲草人工栽培及產(chǎn)品開發(fā)研究概況［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006（2）：268－269.

［9］胡紹庚.17種藥用真菌栽培［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999.

［10］張雪超，王云.蛹蟲草栽培技術(shù)［J］.吉林林業(yè)科技，2009（3）：56－57.

［11］胡若瑛.涼山蟲草的研究［J］.中草藥，1983，14（7）：35－36.

［12］盧建明，曾振基，何煥清.蛹蟲草人工代料培育技術(shù)［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（2）：88－89.

［13］陳順志，吳佩杰.瓶栽蛹蟲草子座的方法［J］.生物學(xué)通報(bào)，1992（1）：44.

［14］梁宗琦.蛹蟲草無(wú)性型及其子實(shí)體人工培養(yǎng)研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1990，3（2）：1－6.

［15］冉翠香，王莉，許智宏.人工培育蛹蟲草子實(shí)體原基的誘發(fā)形成［J］.中國(guó)食用菌，2001，23（4）：9－10.