金 宏 信 宏 于洪泉 溫 娜 唐澤波 齊 玲 劉興吉 (吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 303)

五味子總木脂素是中藥材五味子中的重要組成成分。近年研究表明，五味子總木脂素具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，具有抗腫瘤〔1〕、保護(hù)肝臟和抗氧化作用、抗病毒作用、對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗抑制和抑制作用，以及抑制平滑肌收縮和增強(qiáng)免疫功能、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、促進(jìn)糖原合成等多種作用〔2〕。但該藥物通過何種方式發(fā)揮其各種作用目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在研究五味子總木脂素作用于大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后發(fā)生的效應(yīng)，以及該藥協(xié)同常規(guī)化療藥物順鉑作用后細(xì)胞的反應(yīng)，為該藥早日應(yīng)用于臨床奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640(Thermo公司)、小牛血清、0.25%胰酶(美國Gibco公司);順鉑(阿拉丁公司，中國)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，Thermo公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將配制好的RPMI-1640培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中預(yù)熱，自-80℃冰箱中取出大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，迅速置于37℃水浴至融化，離心后小心吸出上清，將細(xì)胞用1 ml培養(yǎng)基混勻放入培養(yǎng)皿中，再加入9 ml新鮮培養(yǎng)基，輕輕混勻后放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長良好，待80% ～90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 MTT法檢測五味子總木脂素對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用將五味子總木脂素用含5%小牛血清RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液溶解后，配制成終濃度為 0、50、100、200 μg/ml的藥物。取對(duì)數(shù)生長期的腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，用胰酶消化后，用含5%小牛血清RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為8×103/ml。將細(xì)胞懸液均勻接種于96孔板中，每孔100 μl，置入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。棄去上清液，加入含不同濃度的五味子總木脂素，每個(gè)藥物濃度重復(fù)5次。藥物作用結(jié)束時(shí)，每孔加入 MTT 20 μl，37℃ 繼續(xù)孵育 4 h，棄上清液，每孔加DMSO 150 μl，振蕩均勻使MTT沉淀完全溶解，15 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值，用不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。

1.4 MTT法檢測五味子總木脂素聯(lián)合順鉑對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用 將細(xì)胞以8×103個(gè)/孔接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為四組，分別為五味子總木脂素組(200 μg/ml)，順鉑組(10 μg/ml)，聯(lián)合用藥組(五味子總木脂素 200 μg/ml+順鉑10 μg/ml)，對(duì)照組使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基。余下步驟同1.3。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD、DUNCAN法和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6細(xì)胞的培養(yǎng) 大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后培養(yǎng)，細(xì)胞在復(fù)蘇2 h開始貼壁，初期呈圓球形，隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)突起，開始呈現(xiàn)長梭形，24 h后90%以上的細(xì)胞都已貼壁，大部分可見明顯的突起。

2.2 大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞對(duì)五味子總木脂素的敏感性 大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞在藥物低濃度(0.50 μg/ml)時(shí)無明顯的抑制效應(yīng)發(fā)生，OD值分別為0.69±0.03、0.78±0.03，甚至出現(xiàn)輕微的增殖現(xiàn)象，藥物濃度達(dá)到100 μg/ml時(shí)促進(jìn)增殖作用明顯(0.83±0.03)(P ＜0.01)，但當(dāng)藥物濃度達(dá)到200 μg/ml時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯的生長抑制(0.53±0.03)(P＜0.01)，說明五味子總木脂素在低濃度時(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，而藥物濃度達(dá)到200 μg/ml時(shí)，抑制細(xì)胞生長。

2.3 五味子總木脂素聯(lián)合順鉑對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用 大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)五味子總木脂素作用后，其OD值為0.53±0.03，順鉑組OD值為0.64±0.03，木脂素與順鉑聯(lián)合組為0.43±0.01，與對(duì)照組(0.75±0.04)相比，具有顯著性差異(P＜0.01)，而且兩藥聯(lián)合應(yīng)用效果更為顯著，說明五味子總木脂素與順鉑聯(lián)合應(yīng)用在治療膠質(zhì)瘤方面具有協(xié)同作用。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，發(fā)病率約為40.49%，綜合發(fā)病年齡高峰在30～40歲或10～20歲。世界衛(wèi)生組織公布按死亡率順序排位，惡性膠質(zhì)瘤是34歲以下腫瘤患者的第2位死亡原因，是35～54歲患者的第3位死亡原因。膠質(zhì)瘤系浸潤性生長物，它和正常腦組織沒有明顯界限，難以完全切除，對(duì)放療、化療不甚敏感，非常容易復(fù)發(fā)?；瘜W(xué)藥物和一般抗腫瘤的中藥，因血腦屏障等因素的影響，療效也不理想。因此，腦膠質(zhì)瘤至今仍是全身腫瘤中預(yù)后最差的腫瘤之一。

研究表明，中藥五味子具有毒性低〔3〕和明確的抗腫瘤作用〔4～6〕。本研究發(fā)現(xiàn)，五味子總木脂素在低濃度時(shí)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞無明顯的抑制作用，甚至出現(xiàn)輕微的增殖現(xiàn)象，當(dāng)藥物濃度增加到200 μg/ml時(shí)，細(xì)胞生長出現(xiàn)明顯的抑制，這一結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致〔7〕。提示高濃度五味子總木脂素可以有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

順鉑是傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物，但是臨床用藥表明，大劑量應(yīng)用順鉑時(shí)其毒副作用較明顯，人體難以耐受，導(dǎo)致部分患者難以達(dá)到理想的治療效果。本課題組發(fā)現(xiàn)，五味子總木脂素聯(lián)合順鉑能更加有效地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，具有極強(qiáng)的殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力。這一結(jié)論與呂冬霞等〔8〕研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)有力地證實(shí)了五味子總木脂素與順鉑可發(fā)生協(xié)同作用，兩藥聯(lián)合應(yīng)用可以加強(qiáng)藥物的抑瘤作用，但兩個(gè)藥物發(fā)生協(xié)同作用的機(jī)制目前還不明確，聯(lián)合用藥后是否可以減少順鉑用量，在降低毒副作用的同時(shí)達(dá)到最好的治療效果，這些都有待于進(jìn)一步研究。

1 Chiu PY，Lam PY，Yan CW，et al.Schisandrin B protects against solar irradiation-induced oxidative injury in BJ human fibroblasts〔J〕.Fitoterapia，2011;82(4):682-91.

2 吳立軍.天然藥物化學(xué)〔M〕.第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:5.

3 苗明三.五味子多糖對(duì)衰老模型小鼠的影響〔J〕.中國醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2002;17(3):187-8.

4 李先偉，楊解人.五味子乙素抗H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的機(jī)制〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(12):2244-7.

5 任麗佳，李 林，殷放宙，等.五味子抗腫瘤活性成分及作用機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012;28(1):140-2.

6 牟遇霖.五味子抗腫瘤的研究現(xiàn)狀〔J〕.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010;7(2):84-5.

7 金 宏，溫 娜，紀(jì)鵬艷，等.不同濃度五味子乙素對(duì)腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞增殖的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011;15(12):2026-7.

8 呂冬霞，崔 健，劉月霞，等.五味子乙素聯(lián)合順鉑對(duì)H22荷瘤小鼠存活時(shí)間的影響〔J〕.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2008;31(5):9-10.