喬秋杰 曲敬來 高 雪 張 忠

（廣東省深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033）

病炎清顆粒是本課題組20 余年的中醫(yī)疫病臨床經驗方，其采用有效而且具有獨特抗流感病毒作用的中草藥配制而成。本實驗采用MDCK 細胞培養(yǎng)法，觀察病炎清顆粒體外抗甲型流感病毒的抑制作用，并與對照組清開靈注射液、病毒唑進行比較，探討其對甲型流感病毒感染的治療作用及可能的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 藥物 病炎清顆粒：連翹30 g，馬勃30 g，桔梗12 g，牛蒡子20 g，柴胡20 g，黃芩12 g，僵蠶10 g，薄荷12 g，白前12 g，百部12 g，荊芥12 g，莪術10 g，甘草10 g。以上藥物共202 g，加入溫開水稀釋成202 mL，相當于每mL 所含生藥1 g。清開靈注射液，廣州白云山明興制藥有限公司，批準文號：國藥準字Z44022855。病毒唑（三氮唑核苷RIBAVIRIN），浙江康裕藥業(yè)有限公司產品，批號：960501。

1.2 病毒株及細胞株 病毒株：流感病毒甲型A/粵防/243/72（H1N1），中國醫(yī)科院生物技術研究所提供。細胞株：狗腎傳代細胞（MDCK），中國醫(yī)科院生物技術研究所提供。細胞培養(yǎng)液：含10%新生小牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL的鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM 培養(yǎng)液（中國醫(yī)科院生物技術研究所提供）。細胞維持液除所含小牛血清為2%外，其他含量均同細胞培養(yǎng)液。

1.3 藥物處理 病炎清顆粒、清開靈注射液的第一濃度為藥物母液稀釋3 倍，再用培養(yǎng)液作2 倍系列稀釋，共8個稀釋度。稀釋度分別為1∶3、1∶6、1∶12、1∶24、1∶48、1∶96、1∶192、1∶384。

1.4 藥物對MDCK 細胞的毒性試驗 將MDCK 細胞接種于96 孔培養(yǎng)板，置37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 后，形成細胞單層。加入用細胞維持液稀釋的不同濃度待測藥物（稀釋度見上），37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h，顯微鏡觀察細胞形態(tài)，并用噻唑藍（MTT）比色法在590 nm 波長處測定吸光度A 值，按如下式計算細胞存活率，確定藥物的半數(shù)毒性濃度（TD50）和最大無毒濃度（TD0）。每個劑量藥物加入4 孔，同時設正常細胞對照和空白組。細胞存活率（%）=（實驗孔A 值／對照孔A值）×100%

1.5 測試方法 MDCK 細胞種96 孔培養(yǎng)板，24 h 后感染甲型流感病毒，吸附2 h，棄病毒液。加入以上稀釋度的藥物，同時設細胞對照孔和病毒對照孔，觀察24 h細胞病變程度（CPE），用Reed～Muench 法分別計算藥物對甲型流感病毒的半數(shù)抑制濃度（IC50）。并計算選擇指數(shù)（SI＝TD50/IC50）。細胞病變程度表示法：“-”為細胞生長正常，無病變出現(xiàn)；“+”為細胞病變占整個單層細胞的25%以下；“++”為細胞病變占整個單層細胞的50%以下；“+++”為細胞病變占整個單層細胞的75%以下；“++++”為細胞病變占整個單層細胞的75%以上。

2 結果

本實驗各項操作均按病毒學實驗常規(guī)進行［1］。結果表明：病炎清顆粒在1∶24（相當于生藥41.67 mg/mL）稀釋度時達到TD50，在1∶48（相當于生藥20.83 mg/mL）稀釋度時達到TD0，在1∶96（相當于生藥10.42 mg/mL）稀釋度時達到IC50，選擇指數(shù)SI＝4.0。而清開靈注射液在1∶19.4 稀釋度時達到TD50，在1∶35.2 稀釋度時達到TD0；在1∶49.1 稀釋度時達到IC50，選擇指數(shù)SI＝2.53。病毒唑對甲型流感病毒的半數(shù)抑制濃度IC50＝5.91 μg/mL。結果提示，病炎清顆粒對流感病毒甲型所致的細胞病變有一定的抑制作用，優(yōu)于中藥對照組，與西藥對照組相近。

病炎清顆粒在1∶24時相當于生藥41.67 mg/mL，在1∶48時相當于生藥20.83 mg/mL，在1∶96 相當于生藥10.42 mg/mL。

3 討論

中藥抗流感病毒基本原理是扶正祛邪或祛邪扶正。國內外對中藥抗流感病毒有效部位或成分的篩選研究表明［2］：中藥抗流感病毒主要有直接滅活或抑制病毒和通過誘生干擾素或調節(jié)人體免疫功能而間接抑制病毒兩種方式?，F(xiàn)有的研究也表明［3］，中藥復方具有抑制流感病毒復制、阻止流感病毒致細胞病變、調節(jié)免疫功能、改善肺循環(huán)、鎮(zhèn)痛抗炎等綜合作用，使流感痊愈。

病炎清顆粒是本課題組多年的疫病經驗方，本實驗采用MDCK 細胞培養(yǎng)法進行病炎清顆粒抗甲型流感病毒的體外實驗，證實其在體外具有較強的抗甲型流感病毒的作用，且毒副作用小、安全性高；綜合實驗結果，病炎清顆?？辜仔土鞲胁《镜淖饔脵C理可能為既調節(jié)人體免疫功能而間接抑制病毒，又抑制病毒在細胞內部的復制增殖。但由于單味中藥成分復雜不清，復方中藥又涉及單味中藥之間的相互作用，因此對于具有多組分、多種作用途徑的中藥來說，其抗流感病毒機理也相對復雜，尚有待于進一步深入研究。

［1］中國醫(yī)學科學院流行病研究所.常見病毒病實驗技術［M］.北京：科學出版社，1987：213.

［2］馮書曉，陳文，馮俊陽，等.抗流感病毒植物藥有效部位篩選研究概括［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（11）：101.

［3］胡旭，邱全瑛，姜良鐸.中醫(yī)藥抗呼吸道流感病毒感染實驗研究概括［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（2）：180.