汪巧云余 智

（1 浙江省淳安縣第二人民醫(yī)院藥劑科，浙江 淳安 311719；2 廣西桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 桂林 541001）

異丁苯丙酸對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的作用

汪巧云1余 智2

（1 浙江省淳安縣第二人民醫(yī)院藥劑科，浙江 淳安 311719；2 廣西桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 桂林 541001）

目的探討異丁苯丙酸在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用及其機(jī)制。方法通過(guò)線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)再灌注損傷模型，將48只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、異丁苯丙酸組(C組)，每組16只。于術(shù)前3d分別給予相應(yīng)處理，缺血120min再灌注24h后評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能缺損程度，ELISA法測(cè)定大鼠腦組織中IFN-γ含量水平，尼氏染色檢測(cè)大鼠神經(jīng)元數(shù)。結(jié)果與A組相比，其余2組神經(jīng)功能評(píng)分、IFN-γ含量水平均明顯升高，健存神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)；與B組相比，C組神經(jīng)功能評(píng)分及IFN-γ含量水平顯著降低，健存神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.05)。結(jié)論異丁苯丙酸可能通過(guò)減少I(mǎi)FN-γ的釋放，增加健存神經(jīng)元數(shù)，從而對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

異丁苯丙酸；腦缺血/再灌注；炎癥反應(yīng)；神經(jīng)保護(hù)

早已觀察到炎性反應(yīng)與腦缺血再灌注損傷的關(guān)系越來(lái)越受關(guān)注[1]。目前，關(guān)于非甾體抗炎藥對(duì)缺血性腦損傷的作用還不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)采取非甾體抗炎藥異丁苯丙酸，觀察其對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中炎性反應(yīng)、健存神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)的影響，進(jìn)一步探討異丁苯丙酸神經(jīng)保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠（浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)）；異丁苯丙酸購(gòu)自中美天津史克制藥有限公司；IFN-γELISA試劑盒（R&D Systems公司，美國(guó)）；甲苯胺藍(lán) （Promega公司）；Labo fuge 400R高速低溫離心機(jī)（Heraeus公司，德國(guó)），酶標(biāo)儀（BioTek 公司，美國(guó)），電子顯微鏡（OLYMPUS，日本）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥

將48只大鼠（體質(zhì)量240～280g），按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組（n=16），術(shù)前12h禁食，飲水自由。①假手術(shù)組（A組）：術(shù)前3d，1次/d，每次灌胃生理鹽水4mL/kg；②模型組（B組）：缺血前3d，1次/d，每次灌胃生理鹽水4mL/kg；③異丁苯丙酸組（C組）：缺血前3d，1次/d，每次灌胃異丁苯丙酸8mg/kg（溶于蒸餾水 濃度為4%）。

1.2.2 局灶性腦缺血再灌注模型的建立

采用改良的Zea- longa[2]法制備中動(dòng)脈阻斷（MCAO）模型：經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（0.3mL/kg），取頸部左旁正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）及頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎并游離ECA的近端，將蛙心夾夾閉CCA和ICA后在ECA游離段上剪開(kāi)小口將制備好的尼龍線栓經(jīng)CCA分支處通過(guò)ICA入顱，線栓深度為18～19mm。缺血120min后抽出線栓即可造成再灌注模型。模型成功標(biāo)志：蘇醒后出現(xiàn)左側(cè)Horner綜合征；提尾懸拉后出現(xiàn)右上肢蜷縮屈曲；爬行時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈或跌倒。A組大鼠在術(shù)中分離左側(cè)CCA、ECA及ICA，但不做任何缺血處理。

1.3 指標(biāo)評(píng)價(jià)

1.3.1 神經(jīng)功能評(píng)分

再灌注24h后，各組大鼠按Zea-longa5分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下：①無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀，計(jì)0分；②不能伸展右側(cè)前肢，計(jì)1分；③爬行時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，計(jì)2分；④身體向右側(cè)傾倒，計(jì)3分；⑤不能自發(fā)爬行、意識(shí)障礙，計(jì)4分。

1.3.2 IFN-γ含量水平測(cè)定

再灌注24h后，隨機(jī)抽取各組8只大鼠，迅速斷頭取腦。于冰上距額葉前端3mm和9mm處進(jìn)行冠狀分離，取中間6mm厚的腦組織塊，然后沿此腦塊矢狀縫兩側(cè)約2mm處，從上至下切除兩側(cè)半球的正中結(jié)構(gòu)，將左側(cè)腦塊作為檢測(cè)標(biāo)本。嚴(yán)格按ELISA試劑盒檢測(cè)要求進(jìn)行操作。

1.3.3 尼氏染色

嚴(yán)格按照試劑盒檢測(cè)步驟進(jìn)行操作。在光鏡（X400）下觀察健存神經(jīng)元的數(shù)量，計(jì)算尼氏小體的數(shù)目/相應(yīng)的面積并采圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。神經(jīng)功能評(píng)分用中位數(shù)/四分位數(shù)法表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi檢驗(yàn)。多組計(jì)量資料用χ—±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分

A組各大鼠無(wú)神經(jīng)行為功能障礙，評(píng)分（0.0，0.0）明顯低于其余2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=60.018，P＜0.05）；與B組評(píng)分（2.0，3.0）相比，經(jīng)異丁苯丙酸預(yù)處理的C組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分（1.0，2.0）明顯降低，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.96，P＜0.01）。

2.2 干擾素-γ含量水平測(cè)定

A組缺血側(cè)大鼠腦組織中IFN-γ含量水平（2.46±0.57pg/mg）均明顯低于其余2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.205，P＜0.05）；與B組（3.81±0.19pg/mg）相比較，經(jīng)異丁苯丙酸預(yù)處理的C組大鼠IFN-γ含量水平（3.07±0.67pg/mg）均顯著降低，差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.73，P＜0.05）。

2.3 尼氏染色的比較

A組缺血側(cè)頂葉皮層腦組織尼氏小體多且體積大，呈紫色分布于核周圍（9.89±0.81%），與其余2組大鼠相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=116.64，P＜0.01）。B組尼氏小體數(shù)量明顯減少，少量存在的尼氏體也變小或變形（3.65±0.98%），而經(jīng)異丁苯丙酸預(yù)處理的C組相應(yīng)區(qū)域尼氏體數(shù)量較多且變形較少（7.77±0.51%），兩組相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.39，P＜0.01）。

3 討 論

目前認(rèn)為，腦缺血再灌注時(shí)受血流變學(xué)和缺血缺氧的改變引起神經(jīng)細(xì)胞釋放大量炎癥信號(hào)，促進(jìn)炎性細(xì)胞的聚集和炎性因子的釋放[3]，導(dǎo)致缺血損傷區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而加速神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)與炎癥反應(yīng)的其他要素如轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)傳導(dǎo)分子和黏附分子密切相關(guān)。

有研究報(bào)道IFN-γ可通過(guò)活化P38激酶，誘導(dǎo)細(xì)胞因子及Ⅱ類組織相容性復(fù)合體（MHC）的表達(dá)，共同參與細(xì)胞的增殖、分化或凋亡。本研究也發(fā)現(xiàn)模型組IFN-γ含量水平相比假手術(shù)組顯著升高，健存神經(jīng)元數(shù)較假手術(shù)組明顯降低，與Xu 等的研究報(bào)道基本相一致，由此我們推測(cè)IFN-γ在腦缺血再灌注損傷后形成細(xì)胞損傷時(shí)發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

以往在治療和預(yù)防腦缺血時(shí)僅考慮到非甾族抗炎藥，如阿司匹林的抗血小板聚集作用，而忽略了其抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)表明，異丁苯丙酸能明顯增加局灶腦缺血周邊神經(jīng)細(xì)胞的生存數(shù)量。異丁苯丙酸具有較強(qiáng)的抗血小板集聚作用并且能抑制血栓烷的釋放，但此可能不是減輕缺血性腦損傷的機(jī)理，因?yàn)槠渌写俗饔玫目寡姿?，如阿司匹林、消炎痛等并不能防止急性缺血性心肌損害的發(fā)展。異丁苯丙酸可穩(wěn)定溶酶體膜，其他抗炎藥則無(wú)此作用。這種生物膜穩(wěn)定作用能防止或減少水解酶的釋放，后者能使細(xì)胞自溶加重細(xì)胞膜損害。在缺血/再灌注損傷中，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)缺血部位的損害作用有:增加耗氧量；產(chǎn)生大量自由基；填塞微血管和釋放水解酶等。研究證實(shí)異丁苯丙酸可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞減小腦缺血損害范圍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，經(jīng)異丁苯丙酸預(yù)處理后的大鼠神經(jīng)功能缺損較模型組明顯改善，IFN-γ的含量水平顯著降低，并且缺血半暗帶的頂葉皮質(zhì)中健存的神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，由此推測(cè)異丁苯丙酸可減少促炎介質(zhì)（IFN-γ）的含量水平。異丁苯丙酸口服吸收快，用藥后1h血液濃度達(dá)高峰，可在有限的腦缺血治療窗內(nèi)起作用，此點(diǎn)有實(shí)際的臨床意義。

由此可見(jiàn)，吡格列酮可通過(guò)減少促炎介質(zhì)（IFN-γ）的釋放，減輕了大鼠缺血再灌注后的損傷，從而很好的增加健存神經(jīng)元，為該藥在缺血性腦血管疾病的臨床使用提供一定的理論依據(jù)。

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1671-8194（2013）15-0102-02