常艷萍，吳利先

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室，云南 大理671000）

幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）是1982年由澳大亞學(xué)者Warren和Marshall從胃炎和消化性潰瘍病人胃黏膜活體組織中培養(yǎng)出來的一種革蘭氏陰性螺旋形細(xì)長微彎桿菌。Hp感染不僅能引起慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等多種胃腸道疾病，并且HP被證實(shí)為I類致胃癌致病因子［1，2］。此菌在世界不同地區(qū)、不同種族感染率有所差異，尤其在發(fā)展中國家其感染率較高，而我國自然人群感染率約54．76%，而現(xiàn)癥感染率平均高達(dá)55%［3］。因此建立快速、準(zhǔn)確、安全的檢測方法對Hp感染的診斷和治療極為重要。而近些年隨著HP單克隆抗體制備技術(shù)和蛋白組學(xué)的研究深入，Hp酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，膠體金免疫技術(shù)，免疫印跡技術(shù)以及蛋白芯片等免疫診斷方法效能逐步提高，其用于現(xiàn)癥感染和臨床療效觀察中取得了可喜的進(jìn)展，本文就此綜述如下。

1 酶免疫分析診斷法

1．1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免 疫 吸 附 試 驗(yàn) （enzyme linked immunosorbent as－say，ELISA）是用酶標(biāo)記抗體，并將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗用最廣的技術(shù)。ELISA可以采集病人的血液、唾液、尿液及糞便等標(biāo)本檢測抗體。

張林等［4］以重組 Hp熱休克蛋白A亞單位（rHspA）和尿素酶B亞單位（rUreB）的混合物為抗原，制備成 HPELISA診斷試劑檢測126例患者的尿液和血清，顯示HPELISA診斷試劑的特異性和敏感性明顯優(yōu)于以Hp超聲離心上清液為抗原的同類試劑，此試劑檢測血清IgA、尿液IgG、血清IgG的效能依次升高。與血清學(xué)相比，尿液IgG檢測具有更高的敏感性，但服用影響尿液PH值的藥物會影響其檢測結(jié)果。ELISA法檢測尿液中的IgG抗體，其Se為95．45%，Sp為81．25%，π為92．68%［5］。白艷艷等［6］以 Hp重組純化蛋白u(yù)reB為抗原免疫動物制備Hp－ureB單克隆抗體，用間接ELISA法檢測抗體免疫活性，表明Hp－ureB單抗可特異性與Hp結(jié)合，可作為一種新的單克隆抗體試劑盒檢測患者血清中特異性抗體，具有較高的特異性和靈敏性。血清學(xué)方法可以用于對治療療效的觀察，尿液檢測可用于Hp感染診斷，特別適用于流行病學(xué)調(diào)查和治療療效觀察。

近年來 HP－ELISA方法檢測糞便的報道較多，用ELISA檢測糞便中的多克隆抗體，其現(xiàn)癥感染的檢測效果與呼氣試驗(yàn)等同。ELISA方法用于兒童糞便檢測，HpSA檢測的敏感性和特異性分別為93．3%和98．7%［7］。但是，此法會出現(xiàn)假陽性結(jié)果且結(jié)腸內(nèi)長時間滯留Hp，在根除治療后也會出現(xiàn)假陽性結(jié)果［8］。HP－ELISA方法檢測糞便使用方便、廉價、省時，可替代血清學(xué)方法用于流行病學(xué)調(diào)查。但只有在沒有經(jīng)過長時間的運(yùn)輸或者足以影響到結(jié)果的不適當(dāng)?shù)膬Υ鏁r，用HP－ELISA方法檢測糞便HpSA才能有比較高的精度。

ELISA方法對尿液中的IgG抗體檢測不能區(qū)分是現(xiàn)狀感染還是曾經(jīng)感染過，但它仍具有很多優(yōu)點(diǎn)：（1）尿液容易收集，而且其收藏要求很少的技術(shù)，（2）尿液標(biāo)本不需要離心，（3）是一種完全的非侵入性方法且容易操作，（4）尿液測試可以用于醫(yī)院的檢測或者家庭測試，（5）尿液中的Hp特異性IgG抗體，在4℃中冷藏可以至少保存60天，（6）低水平的Hp抗體也可以在尿液中檢測到［9］。從幽門螺桿菌感染者的尿液中檢測抗體，不僅能快速可靠的診斷Hp感染，而且價格低廉，容易操作，適合對未感染人群的檢測。

ELISA法的主要依賴的是天然抗原，抗原必須能產(chǎn)生高度的免疫性，易準(zhǔn)備和純化，而且必須能穩(wěn)定存儲。ELISA法由于操作復(fù)雜，時間較長，給臨床診斷和研究帶來不便，因此出現(xiàn)一些快速檢測試劑盒。目前已研發(fā)出多種商品性的ELISA檢測試劑盒，但公認(rèn)以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫印跡試驗(yàn)為優(yōu)，具有較高的特異性，并能進(jìn)行定量分析，主要適用于流行病學(xué)調(diào)查。

1．2 酶免疫測定

酶免疫測定（enzyme immunoassay，EIA）法是一種新型檢測Hp的非侵入性實(shí)驗(yàn)。其原理是將抗人Hp特異性多克隆抗體包被在反應(yīng)板的反應(yīng)孔中，標(biāo)本中抗原與抗人Hp特異性多克隆抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物反應(yīng)，根據(jù)顯色判斷結(jié)果。鄢盛愷等［10］首次在國內(nèi)應(yīng)用酶免疫測定法檢測幽門螺桿菌糞便抗原（Hp stool antigen），其敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為：94．7%、95．7%和95．1%。酶免疫測定法檢測HpSA具有敏感性高、特異性強(qiáng)，操作簡便的特點(diǎn)，適合普通實(shí)驗(yàn)室作為常規(guī)項(xiàng)目開展。此法既可以用于幽門螺桿菌感染的篩選與診斷，也合適根除治療的檢測。

2 膠體金免疫試驗(yàn)

免疫膠體金技術(shù)（immune colloidal gold technique）是繼同位素、熒光素和酶三大標(biāo)記技術(shù)之后，又一較為成熟且得到廣泛應(yīng)用的免疫標(biāo)記技術(shù)。1971年Faulk和Taytor［11］將膠體金應(yīng)用于免疫化學(xué)后免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。目前用于Hp檢測主要有免疫層析（immunochromatogra－phy）、快速免疫金滲濾法（Dot－immuogold filtration assay，DIGFA），HP快速免疫測試卡和金標(biāo)試條法等，具有簡便、準(zhǔn)確、快速和無污染等優(yōu)點(diǎn)。

2．1 膠體金免疫層析實(shí)驗(yàn)

Cherian，Sarah等［12］193例兒童患者做免疫層析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示靈敏性為74．6%，特異性為63．6%。SILVA等［13］報道，用免疫層析法檢測患者HpSA，其敏感性和特異性分別為88%和87．5%。免疫層析法檢測患者糞便中抗原可以獲得和13C呼氣實(shí)驗(yàn)一樣的診斷效果。

據(jù)報道［14］將HP用膠體金的基因工程HP尿素酶抗原結(jié)合膜免疫層析原理，應(yīng)用雙抗原夾心制成的膠體金標(biāo)記的HP抗原印跡膜，對86例胃、十二指腸患者采集血清標(biāo)本進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示：慢性胃炎，消化性潰瘍和胃癌中的空泡細(xì)胞毒素（VacA）總陽性率分別為56．1%，88．49%和100%?？梢奦acA總陽性率隨著病變嚴(yán)重程度逐漸升高。膠體金法檢測血清Hp抗體可對Hp感染情況進(jìn)行分型。操作簡便且特異性強(qiáng)、敏感度高，結(jié)合其他診斷方法可以準(zhǔn)確對消化道潰瘍及胃癌進(jìn)行臨床診斷及判斷疾病的預(yù)后。賈克東等［15］分別以金免疫抗原檢測、尿素酶實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)抗體檢測3種方法對60例患者進(jìn)行檢測對比。結(jié)果顯示金免疫抗原檢測胃液、糞便和血清標(biāo)本中的準(zhǔn)確率分別為：69．04%，57．14%和40．48%。膠體金免疫法測定Hp抗原診斷Hp感染的敏感性和特異性有待進(jìn)一步提高，但其屬于非侵入性檢查，而且具有簡便、快速、準(zhǔn)確等的優(yōu)點(diǎn)，尤其以胃液和糞便檢測效果更好，具有很大的發(fā)展前景。

2．2 快速免疫金滲濾法

快速免疫金滲濾法（DIGFA）的原理與斑點(diǎn)免疫金染色法相同，只是在硝酸纖維膜下墊有吸水性強(qiáng)的墊料，在加抗原（抗體）后，迅速加抗體（抗原），再加金標(biāo)記第二抗體，在數(shù)分鐘內(nèi)即可顯出顏色反應(yīng)。

有學(xué)者報道［16］采用DIGFA檢測患者末梢血及唾液中的抗Hp－IgG抗體。末梢血抗Hp－IgG法診斷Hp檢測陽性率84%，診斷Hp現(xiàn)癥感染的準(zhǔn)確性分別為72．72%，敏感性為94．64%，特異性分別為35．29%，唾液抗 Hp－IgG法診斷Hp檢測陽性率58%，診斷Hp現(xiàn)癥感染的準(zhǔn)確性分別為90%，敏感性為85．71%，特異性為97．06%。DIGFA法檢測唾液中抗Hp－IgG具有準(zhǔn)確性高、敏感性強(qiáng)、特異性高的優(yōu)點(diǎn)，且為非侵入性、簡便、快速、價廉的方法，適合于臨床推廣。血抗Hp－IgG檢測適合于流行病學(xué)調(diào)查。

2．3 HP快速免疫測試卡

Hp感染引起的消化道潰瘍治愈后，常會出現(xiàn)潰瘍復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的潰瘍病人均有Hp再感染。可見體內(nèi)可能有其它適宜Hp生存的環(huán)境?？谇谎乐艽鼉?nèi)有適合兼性厭氧菌生長的環(huán)境，且菌斑內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)酸可以降低pH值，有利于Hp的生長［17］。因此口腔Hp的檢測對HP的感染診斷和治療有重要意義。

李前等［18］采用幽門螺桿菌快速檢定卡對56例有消化道癥狀的患兒做牙垢幽門螺桿菌抗原檢測，結(jié)果表明：牙垢幽門螺桿菌抗原檢測HP感染的敏感度和準(zhǔn)確性分別為97．9%和91．1%。牙垢幽門螺旋桿菌抗原檢測法是一種非侵人性的Hp檢測法，具有取材方便、操作簡單、快捷，多次重復(fù)獲取牙垢標(biāo)本，患兒無痛苦，又經(jīng)濟(jì)，是兒童HP感染的診斷及治療后復(fù)查最好的方法。成虹等［19］采集患者的糞便標(biāo)本作HpSA快速免疫卡檢測，與“金標(biāo)準(zhǔn)”相比，其敏感度和特異度分別為：100%、93．2%，因此，HpSA快速免疫檢測卡檢測糞便Hp抗原可以用于臨床Hp現(xiàn)癥感染的診斷和Hp根除治療的結(jié)果判斷。

3 免疫印跡技術(shù)

免疫印跡技術(shù)（immunoblotting）：免疫印跡是一種較新的免疫化學(xué)技術(shù)。用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）將Hp中分子量大小不同的蛋白組份分離，得到的不同區(qū)帶與待檢血清中相應(yīng)抗體相結(jié)合，通過顯色來判斷患者Hp感染情況。

免疫印跡檢測Hp特異性標(biāo)記物已多種商品化試劑盒。單克隆抗體夾心ELISA試劑盒，其敏感性為98%－100%，特異性為76%，可以用于根除治療早期診斷［20］。陸海英等［21］應(yīng)用免疫印跡技術(shù)對慢性上消化道患者進(jìn)行HP血清學(xué)分型檢測，結(jié)果顯示I型檢出率為65．08%，Ⅱ型檢出率為28．11%，總檢出率93．20%。但某些檢測出Hp I型抗體陽性的患者，其胃鏡和呼氣試驗(yàn)并不支持患者現(xiàn)在患有慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌等胃腸道疾?。?2］。有學(xué)者報道［23］，用Hp免疫印跡檢測分類抗體試劑盒檢測胃炎患者血清中CagA和VacA，結(jié)果顯示，其敏感性為98．4%，特異性為96%，且可以同時檢測出Hp多種抗體。與14C－UBT組合檢測對Hp診斷和治療有重要意義，尤其可以用于Hp感染分型的檢測。此檢測方法具有較高的特異性和靈敏度，簡便，快速，無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，較適合臨床廣泛推廣應(yīng)用。

4 蛋白芯片技術(shù)

HP抗體蛋白芯片檢測系統(tǒng)利用基因重組技術(shù)包被HP的抗原，經(jīng)微孔濾膜的滲濾、濃縮、凝集作用，使抗原抗體在固相膜上快速反應(yīng)。目前蛋白芯片包被的HP抗原主要有CagA、VacA、Ure、Hsp60及RdxA等5種蛋白，可同時檢測5種抗體。蛋白芯片檢測UreB，CagA和VacA抗體的敏感性分別為93．4%、95．4%和96．0%，特異性為94．8%、94．4%和97．5%。蛋白芯片技術(shù)是一個非常實(shí)用的能快速檢測多重抗體血清樣品的方法，它特別適用HP流行病學(xué)調(diào)查［24］。

5 其他

張愛軍等［25］用金標(biāo)法檢測胃腸道疾病Hp感染病人的血清，其敏感性，特異性和診斷效率分別為88．6%，86．8%和87．1%，和RUT相比無明顯差異。但血清學(xué)檢測具有無創(chuàng)，方便，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于兒童，孕婦等體弱者。由于血清中抗體的持續(xù)存在和產(chǎn)生時間，使其檢測存在假陽性和假陰性，因此不適合對Hp根除治療的判斷，可用作Hp感染的初篩。膠乳凝集試驗(yàn)是以乳膠顆粒作為載體的一種間接凝集試驗(yàn)。用結(jié)合在膠乳顆?；蚰z體金上的Hp抗原檢測微量血中特異性的抗體，根據(jù)出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)進(jìn)行判斷?，F(xiàn)已有商品化試劑盒面市，具有不需特殊儀器，樣本需要量少等優(yōu)點(diǎn)，但準(zhǔn)確性稍低。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、被動血凝反應(yīng)、細(xì)菌凝集反應(yīng)等均可用于Hp菌體抗體的檢測。但是敏感性、特異性、可靠性較低，現(xiàn)在很少應(yīng)用。

6 展望

目前，Hp是危害人類健康的最主要的病原體之一，尤其在發(fā)展中國家的感染率高達(dá)80%。Hp感染不僅引發(fā)胃腸道疾病，近年研究顯示還與心血管、口腔疾病、糖尿病、血液病等多種胃腸道外疾病密切相關(guān)［26，27］。因此對Hp檢測對其調(diào)查現(xiàn)癥感染和療效觀察以及預(yù)后判斷診斷尤為重要，而隨著單克隆抗體技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)以及蛋白芯片等新技術(shù)的應(yīng)用，相信在不久將來，研制出更多高靈敏度和特異度以及經(jīng)濟(jì)簡易的Hp診斷試劑盒，對Hp病原體初診和根治檢查具有重要影響意義。

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