劉曉輝，張效川，辛小玲，白延琴，徐文華，蔡 濤，辛亞平，昝林森

（1.天津市獸藥飼料監(jiān)察所，天津300210；2.吳起縣畜牧局，陜西吳起717600；3.富平縣畜牧獸醫(yī)工作站，陜西富平711700；4.子長縣畜牧獸醫(yī)局史家畔畜牧獸醫(yī)站，陜西子長717300；5.榆林市榆陽區(qū)牛家梁鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，陜西榆林719000；6.渭南市畜牧技術(shù)推廣中心，陜西渭南714000；7.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

酵母是一種肉眼看不見的微小單細(xì)胞微生物，能將糖發(fā)酵成酒精和二氧化碳，是一種天然發(fā)酵劑，分布于整個自然界，它有自己的生命現(xiàn)象，是一種典型的兼性厭氧微生物，在有氧氣和沒有氧氣存在的條件下都能夠存活［1］。酵母菌是人類文明史中被應(yīng)用得最早的真菌類微生物。利用酵母菌發(fā)酵飼草飼料，具有成本低、原料廣、周期短、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，可提高飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化率和吸收率，減少飼料原料浪費(fèi)，同時緩解蛋白質(zhì)飼料資源日益短缺的矛盾，促進(jìn)我國畜牧業(yè)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型，推動畜牧業(yè)進(jìn)一步發(fā)展［2］。本試驗(yàn)采用麥芽浸粉培養(yǎng)基和秸稈粉培養(yǎng)基，利用平板劃線法，從富含酵母菌的青貯飼料和酒糟飼料中分離出酵母菌，經(jīng)過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，從中篩選出優(yōu)良酵母菌株，作為飼料酵母；為飼料酵母及發(fā)酵飼料在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)［3］。

1 材料與方法

1.1 材料

青貯玉米飼料、大麥啤酒糟、麥芽浸粉、秸桿粉。

1.2 方法

采用麥芽浸粉培養(yǎng)基，通過平板劃線法從青貯飼料和酒糟飼料中分離出酵母菌，進(jìn)一步純化，至鏡鑒為穩(wěn)定菌落。采用秸稈粉培養(yǎng)基，對分離到的酵母菌株通過正交試驗(yàn)探索培養(yǎng)條件，優(yōu)化溫度、初始pH、裝液量和接菌量等。培養(yǎng)48h，并測定OD 值。1.2.1 培養(yǎng)基的制備 麥芽浸粉培養(yǎng)基：葡萄糖10g、蛋白胨2g、麥芽浸粉1g、酵母膏1g、瓊脂粉12g、乳酸0.3mL／L、水1 000mL、pH、121 ℃滅菌30min。

玉米秸稈粉培養(yǎng)基：取當(dāng)年生無霉變的優(yōu)質(zhì)干燥玉米秸稈加工而成的0.1mm 粒度細(xì)粉20g、蛋白胨1g、葡萄糖2g、NaCl10g、瓊脂粉20g、蒸溜水1 000mL，pH 6.5～7.0，121 ℃滅菌30min［4］。

1.2.2 增菌培養(yǎng) 在無菌條件下稱量飼料樣品10 g，放入帶有玻璃珠的三角瓶中，加入麥芽浸粉液培養(yǎng)基，180r／min，30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.3 分離、純化酵母菌 用2層無菌紗布過濾增菌液，取濾液1 mL 并稀釋為10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－76個濃度梯度，各取0.5mL 均勻涂在麥芽浸粉培養(yǎng)基平板上，在30 ℃恒溫下培養(yǎng)48～72h，挑選與酵母菌特征菌落相似菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，平板劃線純化，分離純化為單一菌落，無雜菌，編號后轉(zhuǎn)接斜面。

1.2.4 觀察酵母菌菌落形態(tài) 在麥芽浸粉液體培養(yǎng)基平板上接種純化后酵母菌菌株，30 ℃恒溫培養(yǎng)48h，并觀察菌落形態(tài)。觀察是否有發(fā)酵現(xiàn)象，清濁度，沉淀物的疏松度和緊密度等。觀察菌落的形態(tài)大小，厚度，同心圈，輻射線，凹凸度，光滑度、光澤度、透明度、有無褶皺等，顏色及其他特征［5］。

1.2.5 觀察酵母菌形態(tài)及出芽方式 取1 mL 純培養(yǎng)菌液接種在麥芽浸粉培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)，于高倍顯微鏡下觀察出芽過程。

1.2.6 優(yōu)化培養(yǎng)條件 純化培養(yǎng)菌株后，轉(zhuǎn)接到裝有20mL麥芽浸粉液的100 mL 錐形瓶中，180r／min，30 ℃培養(yǎng)48h，并進(jìn)行顯微鏡檢測，4 ℃保存菌液備用。

表1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors level of orthogonal experimental design

表2 各影響因素記錄表Table 2 The record of factors

采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16（44），對培養(yǎng)條件的溫度、初始pH、接菌量、裝液量進(jìn)行4個水平試驗(yàn)，優(yōu)化培養(yǎng)條件，篩選出生長性能好的酵母菌菌株。然后采用玉米秸稈粉培養(yǎng)基，在不同條件下培養(yǎng)48 h，并測定生物量［5］。

通過正交試驗(yàn)L16（44）優(yōu)化篩選出3株菌株進(jìn)行生長曲線測定試驗(yàn)。根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，按照每個菌株最適合的培養(yǎng)條件，在180r／min條件下培養(yǎng)48h。分別在0h、3h、6h、12h、18h、24h、30 h、36h、42h、48h、54h、60h、66h、72h時間點(diǎn)，測定其pH 值，然后將樣液分別分裝在兩個5mL試管中，冰浴使其生長停止。設(shè)3 個重復(fù)，取其中一管測定OD 值，繪制出生長發(fā)育曲線圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離酵母菌菌落和細(xì)胞個體的形態(tài)特征

在高倍顯微鏡下，酵母菌具有典型的真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有細(xì)胞壁、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、線粒體、微體、液泡等。酵母菌通常有球形、橢圓形、臘腸形、卵圓形或者藕節(jié)形等形態(tài)，無鞭毛，不能游動。本試驗(yàn)觀察到酵母菌的生殖方式為出芽生殖（表3）。酵母菌比細(xì)菌大，約1～5μm 或5～30μm，呈乳白色或紅色，表面濕潤、粘稠，少數(shù)干燥，不透明。液體培養(yǎng)發(fā)酵，培養(yǎng)液變渾濁，有的形成浮膜、有沉淀物［6］。

從青貯飼料和大麥啤酒糟中各分離出5株疑似酵母菌珠，進(jìn)行編號1～10。在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)4號和7號菌發(fā)生衰退。其余各酵母菌株的形態(tài)大小、酵母細(xì)胞個體及出芽方式觀察結(jié)果如表3所示。

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化和篩選結(jié)果

采用秸稈粉培養(yǎng)基，對8株分離酵母菌株通過正交試驗(yàn)，對培養(yǎng)條件溫度、初始pH、裝液量和接菌量等進(jìn)行優(yōu)化。培養(yǎng)48h，并測定OD 值，發(fā)現(xiàn)不同酵母菌株的最適宜培養(yǎng)條件很相似，為初始pH為5.5，32℃、接菌量為12mL／L，轉(zhuǎn)速180r／min時，測定的OD 值達(dá)最高，即生物產(chǎn)量最高（表4）。酵母菌株不同，不同的培養(yǎng)條件下各因子對生物產(chǎn)量影響程度也不相同。在最優(yōu)生長條件下，取得最高生物量的前3 株優(yōu)良菌株分別為3 號（OD 值：2.186）、5 號（OD 值：2.179）和9 號（OD 值：2.198）［7］。

表3 酵母菌細(xì)胞個體和菌落形態(tài)特征及出芽方式Table 3 The characteristics and budding of yeast cell in individual and colony morphology

表4 分離酵母菌株正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The orthogonal test results of separation yeast strains

2.3 生長曲線測定

用稀釋培養(yǎng)法（MPN）測定生物量：（1）菌種預(yù)培養(yǎng)。將斜面菌種1環(huán)至盛有50 mL 種子培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，28℃、160r／min振蕩，并培養(yǎng)24h；（2）將上述培養(yǎng)好的菌液按照10%的比例接入另外15瓶裝有50 mL 種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，并標(biāo)號0～15，28 ℃、160r／min 振蕩培養(yǎng)，每間隔2h取出一瓶培養(yǎng)液和1mL菌液，4 000 r／min下離心5 min，棄去上清液，加入9 mL 蒸餾水，使細(xì)胞重新懸浮，在620nm 下比濁。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線［8］。

通過正交試驗(yàn)結(jié)果（表4）篩選出3號、5號和9號菌，測定生長發(fā)育曲線（圖1）。3號菌株的穩(wěn)定期為42～72h，生長對數(shù)期為6～42h，42h達(dá)最高生長點(diǎn)（OD 值：2.132）；5號和9號菌株的生長對數(shù)期均為6～36h，穩(wěn)定期為36～72h，36h達(dá)最高生長點(diǎn)（5號OD 值：1.902；9號OD 值：2.231）。通過比較9株菌株最高生物產(chǎn)量時間點(diǎn)可知，9號菌生物量最高（圖1）。9 號菌送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行鑒定，結(jié)果為釀酒酵母［9］。

圖1 3號、5號、9號酵母菌株生長曲線Fig.1 The growth curve of No.3，No.5，No.9yeast strains

3 結(jié)論

從青貯玉米和大麥啤酒糟飼料中分離10株酵母菌菌株，測定顯微鏡菌落形態(tài)，通過系列試驗(yàn)優(yōu)化篩選，并鑒定其生長曲線，認(rèn)為9號菌株屬于酵母屬，在初始pH 為5.5，溫度為32 ℃、接菌量為12 mL／L，裝液量為100mL／瓶，轉(zhuǎn)速180r／min，培養(yǎng)36h時生物產(chǎn)量達(dá)到最高，OD 值為2.231。經(jīng)過鑒定9號菌株為釀酒酵母。

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