彭子原,袁興中*,彭 馨,黃華軍,崔凱龍,趙艷鴿

(1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙410082；2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410082)

逆膠束(RMS,也稱反膠團(tuán)、反膠束)是由溶解在含有微量水的有機(jī)溶劑中的表面活性劑自組裝形成的聚集體[1].其中,表面活性劑分子疏水的非極性尾部指向有機(jī)溶劑,親水的極性頭部聚集形成納米級(jí)中心水核[2],可增溶酶等親水性物質(zhì).逆膠束具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,其中心水核能較好的模擬酶的天然微環(huán)境[3],其極性頭部殼能隔離酶與有機(jī)溶劑[4].這些特征使逆膠束能有效提高多種酶在有機(jī)相中的活性及穩(wěn)定性.因此,近年來逆膠束酶體系受到越來越多的關(guān)注.

漆酶(Laccase,E.C.1.10.3.2)是一種含銅的氧化酶,存在于高等植物、白腐真菌、細(xì)菌等多種生物之中,可催化氧化大部分酚類和芳香胺類化合物[5],目前已被廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成、生物制藥、生物檢測(cè)、食品工業(yè)、造紙工業(yè)等領(lǐng)域[6],有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值.除此之外,研究發(fā)現(xiàn),由于具有催化木質(zhì)纖維素降解、催化酚類污染物氧化及使偶氮染料脫色等特性,漆酶在降解含木質(zhì)纖維素的廢棄物、處理含酚類污染物的工業(yè)廢水及印染廢水脫色等環(huán)境保護(hù)相關(guān)領(lǐng)域也有很大的發(fā)展?jié)摿6],被譽(yù)為“綠色化學(xué)的酶”[7].因此,研究漆酶催化性能對(duì)資源節(jié)約、環(huán)境保護(hù)有著重要意義.

以往對(duì)漆酶的研究多局限于水介質(zhì)中[8-9],逆膠束酶體系出現(xiàn)后漆酶在逆膠束中的催化性能開始受到關(guān)注.傳統(tǒng)的逆膠束酶體系通常采用化學(xué)表面活性劑.由于化學(xué)表面活性劑具有毒性、難溶解性、難生物降解性等缺點(diǎn),使用化學(xué)表面活性劑構(gòu)建的逆膠束體系不僅會(huì)對(duì)包裹其中的酶產(chǎn)生毒性,不利于其活性的保持,還可能對(duì)環(huán)境造成二次污染[10].同傳統(tǒng)化學(xué)表面活性劑相比,生物表面活性劑直接產(chǎn)生于生物的代謝過程,具有低毒性、可生物降解性、生態(tài)相容性等優(yōu)點(diǎn),是環(huán)境友好型的天然表面活性劑,其研究對(duì)于推進(jìn)逆膠束酶體系的應(yīng)用意義重大[11].然而目前對(duì)基于生物表面活性劑的逆膠束體系中酶的催化性能的研究報(bào)道仍然較少.

本文采用生物表面活性劑——鼠李糖脂(RL)構(gòu)建逆膠束,研究了漆酶在該體系中的催化性能.以單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了有機(jī)相組成、RL濃度、逆膠束體系含水率W0、緩沖溶液酸堿度及鹽濃度對(duì)該體系中漆酶的活性及穩(wěn)定性的影響.此外,通過與同濃度傳統(tǒng)化學(xué)表面活性劑磺基琥珀酸二乙基己酯鈉(AOT)逆膠束體系中漆酶的催化性能的對(duì)比,旨在證明生物表面活性劑逆膠束體系在保持酶催化性能上的優(yōu)越性,為生物表面活性劑逆膠束酶體系的發(fā)展及應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 2,6-二甲氧基酚(2,6-DMP,Sigma)、漆酶(Sigma)、磺基琥珀酸二乙基己酯鈉(AOT,Sigma),鼠李糖脂RL(實(shí)驗(yàn)室自制[12]),正己醇、異辛烷、檸檬酸、檸檬酸鈉、氯化鉀等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,水為去離子水.

1.1.2 主要儀器 紫外分光光度計(jì)(Shimadzu UV-2552,Japan);pH計(jì)(PHS-2F,上海雷磁儀器廠);磁力攪拌儀(RCT,IKA);電子天平(AL204,梅特勒-托利多儀器有限公司);超聲波清洗儀(JMTD-A3,北京金門通達(dá)機(jī)電設(shè)備有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 逆膠束酶體系的配制 以一定比例的正己醇/異辛烷混合溶劑作為逆膠束油相,以10mmol/L的一定pH值和KCl濃度的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液作為水相.將10μL漆酶濃度為10mg/mL的含酶緩沖溶液和一定量相同pH值和KCl濃度純緩沖溶液加入含有5mL混合有機(jī)溶劑的錐形瓶中,磁力攪拌至均勻,制得RL-正己醇/異辛烷-漆酶逆膠束溶液.通過調(diào)節(jié)含酶緩沖溶液和純緩沖溶液的pH值和KCl濃度控制逆膠束酶體系的水相酸堿度和鹽濃度,調(diào)節(jié)純緩沖溶液體積控制體系的含水量.逆膠束的含水量以含水率W0(無量綱,其大小等于緩沖液總摩爾濃度與表面活性劑摩爾濃度之比)來表示.

1.2.2 漆酶酶活測(cè)定 漆酶能催化氧化2,6-二甲氧基酚(2,6-DMP,以下簡(jiǎn)稱DMP),其聚合產(chǎn)物C-C偶氮聯(lián)合物 3,5,3′5′-四甲氧基二苯醌(TMDQ)在470nm處有特征吸收峰.以DMP為底物可測(cè)定逆膠束中漆酶的酶活.取2.9mL配制好的RL-正己醇/異辛烷-漆酶逆膠束溶液,加入100μL 300mmol/L的DMP-正己醇/異辛烷混合溶液,迅速振蕩均勻,室溫下反應(yīng)3min,并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量470nm處該混合體系吸光度隨時(shí)間的變化曲線.以初始反應(yīng)速率定義漆酶酶活,一個(gè)酶活單位(U)定義為每分鐘1mg漆酶催化DMP氧化所引起的吸光度改變量.

1.2.3 逆膠束體系中漆酶催化性能的表征 配制一定參數(shù)的RL-正己醇/異辛烷逆膠束-漆酶體系后迅速測(cè)定體系中漆酶酶活,將該值定義為體系的初始酶活(IA);將配制好的逆膠束酶體系于室溫下靜置90min后再次測(cè)定體系中的漆酶酶活,將該值定義為體系的剩余酶活(RA);定義剩余酶活與初始酶活的比例為體系中漆酶的相對(duì)穩(wěn)定性 (RS).

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)溶劑組成對(duì)漆酶催化性能的影響

與大多數(shù)表面活性劑一樣,鼠李糖脂只有在助表面活性劑存在的條件下才能在異辛烷中形成穩(wěn)定的逆膠束.助表面活性劑是一類對(duì)表面活性劑分子有強(qiáng)吸引力的油溶性化合物,它能增加表面活性劑在烴中的溶解度,減弱表面活性劑極性頭部間的相互作用,使他們更容易聚集成逆膠束極性外殼[13].助表面活性劑與有機(jī)溶劑一起構(gòu)成逆膠束的有機(jī)相,其具體組成比例將對(duì)其中酶的催化性能產(chǎn)生重大影響.本實(shí)驗(yàn)以異辛烷為溶劑,以常用助表面活性劑正己醇為助表面活性劑構(gòu)建鼠李糖脂逆膠束,設(shè)置一系列正己醇/異辛烷體積比(V正己醇/V異辛烷分別為 1：2;1：1.8;1：1.6;1：1.4;1：1.2;1：1),以改變有機(jī)相的組成,研究其對(duì)逆膠束中漆酶催化性能的影響,其結(jié)果如圖1所示(每個(gè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行,取平均值,其他實(shí)驗(yàn)同理).其他參數(shù)分別為：鼠李糖脂濃度 13mmol/L,含水率W0=42,水相pH 5.0,水相KCl濃度10mmol/L.

圖1 有機(jī)相組成對(duì)RL逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.1 Effect of organic phase on the catalytic performance of laccse in RL-RMS

由圖 1 看出,當(dāng)V正己醇/V異辛烷低于 1：1.8(正己醇體積分?jǐn)?shù)為35.7%)時(shí),適當(dāng)增加正己醇含量,逆膠束中漆酶的活性及穩(wěn)定性均有所提高,這可能是因?yàn)檩^低濃度醇的加入能增加逆膠束結(jié)構(gòu)的剛性[14],且能減弱表面活性劑極性頭部與酶蛋白之間的相互作用[15],從而減緩酶在逆膠束中心的失活.但當(dāng)其體積比超過1：1.8后,繼續(xù)增加正己醇含量漆酶的活性及穩(wěn)定性都明顯降低,這可能是由于過高濃度的醇抑制了逆膠束界面的流動(dòng)性,降低了酶與底物接觸的幾率,從而導(dǎo)致酶活的下降[16].此結(jié)果與AOT逆膠束中正己醇含量對(duì)角質(zhì)酶活性的影響[14]及CTAB逆膠束中正己醇對(duì)木素過氧化物酶活性影響[15]的研究結(jié)果類似.

2.2 RL濃度對(duì)漆酶催化性能的影響

作為逆膠束的重要組成之一,表面活性劑對(duì)維持逆膠束的特殊結(jié)構(gòu)及逆膠束體系中酶的催化性能至關(guān)重要[2].保持其他條件不變(V正己醇/V異辛烷=1：1.8,含水率W0=42,水相 pH5.0,水相 KCl濃度10mmol/L),設(shè)置一系列RL濃度,考察鼠李糖脂濃度對(duì)體系中漆酶催化性能的影響,其結(jié)果如圖2所示.

圖2 RL濃度對(duì)RL逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.2 Effect of RL concentration on the catalytic performance of laccse in RL-RMS

圖2顯示,當(dāng)鼠李糖脂濃度低于13mmol/L時(shí),逆膠束體系中漆酶的初始酶活、剩余酶活和相對(duì)穩(wěn)定性隨著其濃度的增加而上升,當(dāng)RL濃度達(dá)到13mmol/L時(shí),3項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到最大值.但當(dāng)其濃度超過該值后,繼續(xù)增加RL含量反而會(huì)對(duì)漆酶的活性產(chǎn)生抑制,其穩(wěn)定性也隨之下降.此結(jié)果與張文娟等[17]對(duì)木素過氧化物酶在Brij30逆膠束中催化性能的研究結(jié)果相似.

表面活性劑對(duì)逆膠束酶體系的具體作用機(jī)理較為復(fù)雜.目前普遍認(rèn)為表面活性劑濃度主要通過影響逆膠束聚集體數(shù)目等性質(zhì)及酶和底物在逆膠束體系中的分配這2個(gè)方面來影響酶在逆膠束體系中的催化性能[18]：在較小范圍內(nèi),提高RL濃度能增加逆膠束聚集體的數(shù)目,有利于漆酶在逆膠束中心水核的溶解,同時(shí)也增加了酶與底物相互作用的聚集體的數(shù)目,使酶的催化活性及穩(wěn)定性提高.然而濃度過高的RL可能抑制底物或產(chǎn)物在有機(jī)相及逆膠束中心水核間的擴(kuò)散,進(jìn)而影響逆膠束中酶的催化性能[19].

2.3 含水率W0對(duì)漆酶催化性能的影響

緩沖溶液總含量與表面活性劑含量的摩爾比為逆膠束酶體系的含水率W0,它是決定逆膠束酶體系中酶催化性能的主要因素之一.圖3為逆膠 束體系中V正己醇/V異辛烷=1：1.8,RL 濃度13mmol/L,水相 pH5.0,緩沖溶液 KCl濃度10mmol/L時(shí),不同W0對(duì)漆酶催化性能的影響.

圖3 含水率W0對(duì)RL逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.3 Effect of W0on the catalytic performance of Laccase in RL-RMS

結(jié)果表明,體系中漆酶的催化活性隨W0的變化曲線為鐘罩型曲線：當(dāng)體系含水率較低時(shí),增大W0將顯著提高漆酶的初始酶活及剩余酶活,當(dāng)W0=42時(shí),2項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到峰值,但超過此臨界值后繼續(xù)增大W0,初始酶活和剩余酶活迅速下降.逆膠束中的水以自由水和結(jié)合水2種形式存在[20].當(dāng)逆膠束體系含水率過低時(shí),大部分水都是與表面活性劑相結(jié)合的結(jié)合水,自由水含量較少,中心水核粒徑較小,限制了酶構(gòu)象的變化,使其難以轉(zhuǎn)化為具有催化作用的活性構(gòu)象,因此表現(xiàn)出來的酶活較低;然而過高的含水率會(huì)使逆膠束中心水核自由水過多,大大增加了酶的流動(dòng)性,不利于其活性構(gòu)象的保持,也將影響酶的活性[14].

與酶活的變化規(guī)律不同,隨W0增加,逆膠束酶體系中漆酶的相對(duì)穩(wěn)定性呈遞減趨勢(shì).這是因?yàn)樵谳^高含水率下,酶結(jié)構(gòu)的剛性減弱,容易失活[21].從圖3看出,當(dāng)W0低于42時(shí),隨含水率的上升,漆酶活性增加迅速,與之相比相對(duì)穩(wěn)定性下降得較為緩慢,綜合考慮,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中含水率均采用42.

2.4 水相酸堿度對(duì)漆酶催化性能的影響

逆膠束中酶所處微環(huán)境的pH值決定了酶所帶電荷的種類,其改變將對(duì)逆膠束中酶的催化構(gòu)象、溶解能力及酶與表面活性劑分子間相互作用力產(chǎn)生影響,從而影響逆膠束中酶的催化性能[22].固定其它條件不變(V正己醇/V異辛烷=1：1.8,RL 濃度13mmol/L,W0=42,KCl濃度10mmol/L),通過改變緩沖溶液pH值控制逆膠束酶體系中水相的pH值,觀察逆膠束水相pH值的改變對(duì)體系中漆酶催化性能的影響,其結(jié)果如圖4所示.

圖4 水相pH值對(duì)RL逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.4 Effect of aqueous phase pH value on the catalytic performance of laccase in RL-RMS

從圖4看出,當(dāng)水相pH值在3.0～5.0之間時(shí),體系中漆酶活性與水相pH值呈正相關(guān),當(dāng)pH＞5.0時(shí),繼續(xù)增大pH值漆酶活性下降.漆酶穩(wěn)定性隨水相pH值變化的規(guī)律與其活性變化規(guī)律一致.此結(jié)果與Carvalho等[18]的研究結(jié)果相似.該結(jié)果說明,在RL逆膠束體系中漆酶表現(xiàn)最高催化性能的最適pH值為5.0,該值略高于其在水溶液中的最適pH值(約為4.5),類似的情況在以往對(duì)逆膠束酶體系的研究中也常見報(bào)道[5,23].這可能是因?yàn)槭罄钐侵顷庪x子表面活性劑,其表面所帶的負(fù)電荷能提高界面周圍的質(zhì)子濃度,使界面周圍的局部pH值下降,從而導(dǎo)致酶的最適水相pH值向高值移動(dòng)[24].

2.5 水相鹽濃度對(duì)漆酶催化性能的影響

逆膠束中心水核鹽濃度對(duì)逆膠束體系中酶的催化性能有顯著影響,是構(gòu)建逆膠束酶體系時(shí)是因考慮的另一因素.以KCl為代表,研究鹽濃度對(duì)RL逆膠束中漆酶催化性能的作用.圖5固定逆膠束酶體系其他條件參數(shù)不變(V正己醇/V異辛烷=1：1.8,RL 濃度 13mmol/L,含水率W0=42,水相pH5.0),僅改變RL逆膠束緩沖溶液KCl濃度時(shí)漆酶活性及穩(wěn)定性的變化趨勢(shì).

圖5 水相KCl濃度對(duì)RL逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.5 Effect of aqueous phase KCl concentration on the catalytic performance of laccase in RL-RMS

逆膠束中心水核鹽濃度主要通過改變逆膠束結(jié)構(gòu)和酶的性質(zhì)2個(gè)方式來影響逆膠束中酶的催化性能.水相中的鹽離子能影響表面活性劑分子極性頭部間的靜電作用,從而引起逆膠束聚集體大小和數(shù)目的改變[14].當(dāng)鹽濃度較低時(shí),適當(dāng)增加鹽濃度能縮小逆膠束中心水核的體積,增加逆膠束結(jié)構(gòu)的剛性,有利于溶解在其中的酶保持其催化活性[14].然而過高濃度的鹽可能使酶蛋白變性失活.由圖5看出,當(dāng)逆膠束酶體系中水相KCl濃度低于10mmol/L時(shí),增加其含量雖然對(duì)漆酶初始酶活的影響較小,卻能顯著提高其相對(duì)穩(wěn)定性.但當(dāng)KCl濃度超過該值后,繼續(xù)增大其濃度漆酶相對(duì)穩(wěn)定性不再有明顯提高,卻將使酶活迅速下降.綜合考慮,認(rèn)為10mmol/L為該逆膠束體系中漆酶催化反應(yīng)的最適水相KCl濃度.

2.6 與化學(xué)表面活性劑逆膠束的對(duì)比

不同種類的表面活性劑會(huì)對(duì)溶解在其中的酶的催化性能產(chǎn)生不同的影響.本課題組在前期研究中已發(fā)現(xiàn),與水介質(zhì)相比,鼠李糖脂逆膠束中的漆酶具有更好的催化性能[25].為進(jìn)一步探討其與傳統(tǒng)化學(xué)表面活性劑逆膠束對(duì)漆酶催化作用影響的差異,比較了相同表面活性劑濃度的鼠李糖脂逆膠束與常用化學(xué)表面活性劑AOT逆膠束中,漆酶在各自最適條件下的催化性能,其結(jié)果如表1所示.

表1 RL逆膠束與AOT逆膠束中漆酶催化性能的對(duì)比Table 1 Comparison of laccase’s catalytic performance in synthetic surfactant-based reverse micelle and RL-RMS

表1顯示,RL逆膠束中漆酶的初始酶活高于同濃度AOT逆膠束中的初始酶活,AOT逆膠束中漆酶的活性在90min內(nèi)下降到50%以下,而RL逆膠束中的漆酶具有較好的穩(wěn)定性,其活性在90min后仍維持在70%左右.這是因?yàn)槿斯ず铣傻幕瘜W(xué)表面活性對(duì)溶解在其逆膠束中的酶具有一定的毒性,而鼠李糖脂是產(chǎn)生自生物的代謝過程中的生物表面活性劑,它對(duì)生物的毒性較低,具有更高的生物相容性,使溶解在其逆膠束中的酶表現(xiàn)出較好的催化性能[10].說明與傳統(tǒng)化學(xué)表面活性劑相比,生物表面活性劑在構(gòu)建逆膠束酶體系上具有一定的優(yōu)越性.

3 結(jié)論

3.1 漆酶在基于鼠李糖脂生物表面活性劑構(gòu)建的逆膠束中具有較高的催化活性及較好的穩(wěn)定性,其大小受到逆膠束有機(jī)相組成、表面活性劑濃度、含水率W0、水相酸堿度、水相鹽濃度等條件的影響.在鼠李糖脂-正己醇/異辛烷逆膠束中,漆酶體現(xiàn)出最佳催化性能的條件為：正己醇/異辛烷體積比為1：1.8,RL濃度為13mmol/L,含水率W0=42,水相pH5.0,水相KCl濃度10mmol/L.

3.2 鼠李糖脂逆膠束中漆酶的活性和穩(wěn)定性均高于同濃度的AOT逆膠束,說明使用生物表面活性劑代替化學(xué)表面活性劑有利于提高逆膠束體系中酶的催化性能.

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