李曉鳳 李淑英 聶瑩 杜歡 楊帆 童大磊 韋日清 趙仲麟 唐選明

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193； 2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018； 3. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，鄭州 450002）

從微生物代謝產(chǎn)物中尋找控制有害生物的生物農(nóng)藥是新農(nóng)藥研究的一個(gè)重要方向[1]。隨著環(huán)境保護(hù)、綠色食品及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要，農(nóng)用抗生素作為低毒低殘留的生物農(nóng)藥日益受到人們的重視[2]。目前，從微生物中發(fā)現(xiàn)的大約8 000種生物活性物質(zhì)中近70%是由放線菌產(chǎn)生的[3]。

T151是從土壤中分離純化得到的一株具有抑菌活性的放線菌，為了研究該菌株是否具有潛在生防利用價(jià)值和田間應(yīng)用前景，我們對(duì)發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物的抑菌作用范圍及其在不同條件下抑菌活性的穩(wěn)定性作了初步分析，旨在為T151的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 放線菌T151本實(shí)驗(yàn)室從海南?？谑薪嫉耐寥乐蟹蛛x得到；指示菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）和根霉（Rhizopus）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 儀器 恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-200H，上海智城分析儀器制造有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-50A，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、三目生物顯微鏡（XSP-BM10A，上海光學(xué)儀器六廠）、大型離心機(jī)（CR22GⅡ，日本日立）、透射電子顯微鏡（H-T500，日本日立）。

1.1.3 培養(yǎng)基 根霉培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。枯草芽孢桿菌和大腸桿菌培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。T151發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉2%、黃豆餅粉0.2%、大米粉0.2%、葡萄糖0.5%、酵母粉0.2%、KNO30.2%、NaCl 0.1%、K2HPO40.1%、MgSO40.05%、CaCO30.3%。 所 有 培養(yǎng)基均在120℃下滅菌40 min備用。

1.2 方法

1.2.1 菌種鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：采用埋片法[4]在發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株T151，用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察拍照。分子生物學(xué)鑒定：提取T151的基因組，放線菌16S rDNA擴(kuò)增引物及方法參照文獻(xiàn)[5]，擴(kuò)增片段送Invitrogen公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站利用Blast進(jìn)行比對(duì)，調(diào)出相似序列，用Clustal X1.83和MEGA 3.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[6]。

1.2.2 抑菌活性分析 采用管碟法[3，7-9]，分別以大腸桿菌，枯草芽孢桿菌和根霉為指示菌，測(cè)定T151發(fā)酵液的抑菌活性。試驗(yàn)重復(fù)3次，以十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑大小。

1.2.3 發(fā)酵液活性物質(zhì)穩(wěn)定性分析 以枯草芽孢桿菌為指示菌，采用管碟法測(cè)定發(fā)酵液在不同條件下處理后的抑菌活性，根據(jù)抑菌圈直徑的改變確定其穩(wěn)定性[3，9-11]。

熱穩(wěn)定性分析：各取發(fā)酵液2 mL，分別置于80℃、90℃、100℃和110℃條件下加熱20 min和30 min，測(cè)抑菌活性，試驗(yàn)重復(fù)3次。

酸堿穩(wěn)定性分析：各取5 mL發(fā)酵液，分別用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH，分別調(diào)到pH為3、5、7、9、11和12，并放置于冰箱4℃，12 h，然后將各pH調(diào)回7左右，測(cè)抑菌活性，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 T151菌種鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)特征 T151菌落緊密、多皺，菌絲體呈淡紫灰色。如圖1所示，光學(xué)顯微鏡下菌絲體呈直立或柔曲。如圖2所示，掃描電鏡下其孢子絲呈鏈狀直絲，孢子表面光滑無突起，孢子呈圓柱狀兩端方正平滑，參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》，該菌株總體表現(xiàn)為鏈霉菌屬特點(diǎn)。

圖1 T151光學(xué)顯微鏡形態(tài)觀察

圖2 T151電子顯微鏡形態(tài)觀察

2.1.2 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建 PCR擴(kuò)增所得T151菌株16S rDNA全長(zhǎng)1 486 bp，將T151的16S rDNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast 比對(duì)，與T151菌株16S rDNA同源性較高的菌株均為鏈霉菌屬放線菌，從中選擇15條同源性高于99%的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示，T151菌株與Streptomycessp. SHXFF-2 partial 在同一分枝上，結(jié)合菌株形態(tài)特征，初步鑒定T151為鏈霉菌新種。

2.2 T151發(fā)酵液抑菌活性分析

從表1可以看出，T151的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)3種指示菌均有明顯的抑菌活性。對(duì)G-細(xì)菌大腸桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈面積為593.66 mm2；其次為G+細(xì)菌枯草芽孢桿菌，抑菌圈面積達(dá)到490.63 mm2；對(duì)真菌根霉也有明顯的抑制作用，抑菌圈面積為200.96 mm2。

2.3 T151發(fā)酵液的穩(wěn)定性分析

圖3 T151的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 T151發(fā)酵液對(duì)3種指示菌的抑制效果

2.3.1 熱穩(wěn)定性 如圖4所示，隨著對(duì)T151發(fā)酵液處理溫度的升高，處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌圈直徑減小。菌株T151發(fā)酵液分別在80℃、90℃和100℃處理20和30 min，抑菌活性變化不是很大；而發(fā)酵液在110℃條件下處理20 min后，抑菌活性大幅度降低，處理30 min后活性消失。以上結(jié)果表明，T151發(fā)酵液在80-100℃內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定性，而當(dāng)溫度升高到110℃時(shí)，穩(wěn)定性急劇下降。

圖4 T151發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性

2.3.2 酸堿穩(wěn)定性 如圖5所示，T151發(fā)酵液在pH5-11條件下抑菌活性比較穩(wěn)定，抑菌圈直徑幾乎沒有變化，而pH 在3和12時(shí)，抑菌效果明顯降低，特別是在堿性環(huán)境下。說明T151發(fā)酵液中活性成分對(duì)強(qiáng)酸強(qiáng)堿的穩(wěn)定性較差。

圖5 T151發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性

3 討論

隨著對(duì)土壤放線菌代謝特性的深入研究，以及分離和培養(yǎng)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，越來越多的土壤放線菌將得到分離，土壤放線菌豐富的多樣性將不斷地被揭示。鏈霉菌一直被認(rèn)為是產(chǎn)生各種抗生素的主要來源。遺傳多樣性分析表明，鏈霉菌屬可產(chǎn)生的抗生素約有上萬種，而目前發(fā)現(xiàn)的只是很小一部分。隨著微生物對(duì)已有抗生素抗藥性的增加，人類對(duì)新的藥物資源的需求越來越迫切。但隨著已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的微生物源化合物數(shù)量的增加，從普通環(huán)境中分離篩選新的活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的難度日益上升。可見，從土壤環(huán)境中篩選稀有菌種已經(jīng)成為當(dāng)前微生物資源開發(fā)利用的重要研究課題。

本研究所用放線菌T151是從海南海口市郊的土壤中分離得到，綜合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定，該菌株屬于鏈霉菌屬。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株發(fā)酵液具有廣譜的抗菌活性，對(duì)G+細(xì)菌、G-細(xì)菌和真菌均有較強(qiáng)的抑制作用，并且對(duì)細(xì)菌的抑菌作用強(qiáng)于對(duì)真菌的抑菌作用。穩(wěn)定性分析表明，發(fā)酵液中具有抗菌作用的活性成分對(duì)熱、酸堿具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，這些研究對(duì)于活性物質(zhì)的進(jìn)一步分離、純化、結(jié)構(gòu)解析和功能研究等提供了理論依據(jù)。

后續(xù)研究中，還有待對(duì)該菌種進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定；還需要分離純化活性成分，對(duì)活性成分進(jìn)行鑒定和系統(tǒng)的抗菌譜研究等。

4 結(jié)論

T151的形態(tài)學(xué)觀察表明，該菌株具有典型的鏈霉菌屬特征；16S rDNA鑒定結(jié)果證實(shí)，該菌株與Streptomycessp. SHXFF-2 partial處于同一分枝上，是鏈霉菌屬新種；發(fā)酵液的抗菌活性研究表明，T151的發(fā)酵液具有較強(qiáng)的抗菌活性，該菌株對(duì)G+細(xì)菌枯草芽孢桿菌、G-細(xì)菌大腸桿菌和真菌根霉均有較強(qiáng)的抑制作用；穩(wěn)定性分析表明，T151發(fā)酵液具有較強(qiáng)的熱、酸堿穩(wěn)定性，具有較強(qiáng)的可操作性。

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