江錫兵 張志毅 龔榜初

（1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，富陽 311400；2. 北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實驗室林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，北京 100083）

經(jīng)典的植物學(xué)分類方法是形態(tài)鑒定方法，由于表型性狀易受環(huán)境條件的影響，親緣關(guān)系相近的物種之間在形態(tài)上差異性較小，利用表型性狀鑒定有時會造成品種鑒定的準(zhǔn)確性不夠，因而很難完整而正確地揭示一些物種之間的親緣關(guān)系。分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展及實驗技術(shù)的突破，使人們可以在基因組水平上對生物進行指紋分析，進而形成了分子分類技術(shù)［1］。利用現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)進行分類和鑒定可以從本質(zhì)上為植物分類和鑒定提供依據(jù)，同時可以鑒別形態(tài)分類的準(zhǔn)確性。

楊樹作為重要經(jīng)濟栽培樹種，育種學(xué)家選育出了大量的優(yōu)良無性系在世界范圍內(nèi)廣泛交流應(yīng)用，然而，僅僅利用形態(tài)鑒定優(yōu)良無性系之間的差別存在著極大的局限性，因此，構(gòu)建指紋圖譜進行無性系鑒定和良種登記顯得尤為重要。指紋圖譜鑒別無性系具有準(zhǔn)確迅速等優(yōu)點，意大利的Castiglione［2］利用RAPD 標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了32個楊樹無性系的指紋圖譜，結(jié)果表明利用這一技術(shù)可以有效區(qū)分那些形態(tài)學(xué)上無法鑒別的無性系。尹佟明等［3］利用AFLP標(biāo)記技術(shù)對42個美洲黑楊無性系進行了指紋分析，發(fā)現(xiàn)根據(jù)每一無性系的特征譜帶組合可以鑒別不同的無性系。

本研究以美洲黑楊與大青楊12個雜種無性系為材料，其中7個在生長量或抗寒性方面表現(xiàn)優(yōu)良［4］，采用AFLP 標(biāo)記技術(shù)從分子水平上對無性系進行鑒別，構(gòu)建其指紋圖譜，旨在為楊樹雜種無性系鑒定以及新品種審定、保護奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料為李善文［5］通過人工雜交獲得的12 個美洲黑楊與大青楊雜種無性系，12 個無性系獲得于3 個雜交組合，無性系編號及其雜交組合父母本來源，如表1所示。

表1 雜種無性系編號及其父母本來源

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取純化 取12 個雜種無性系材料的新鮮葉片各5 g，標(biāo)號，在液氮中迅速研磨成粉末，采用天根生化科技（北京）有限公司提供的植物基因組DNA 提取試劑盒（操作方法見說明書）提取12 份材料的基因組DNA，風(fēng)干后溶于TE 緩沖液；用RNA 酶進行純化處理后在1% 瓊脂糖凝膠上進行電泳，并測定樣品DNA 濃度，根據(jù)測定結(jié)果，將所有樣品DNA 稀釋至相應(yīng)濃度，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶切和接頭連接 采用內(nèi)切酶EcoR I和MseI對DNA 樣品進行雙酶切，并加入EcoR I接頭和MseI接頭的混合物對酶切產(chǎn)物進行連接，酶切連接反應(yīng)體系參照李博方法［5］，37℃ 恒溫酶切連接≧ 4 h。

1.2.3 預(yù)擴增 將酶切連接產(chǎn)物稀釋若干倍作為預(yù)擴增模板，預(yù)擴增采用E00+ M00的引物組合（表1），引物合成于上海英駿生物技術(shù)有限公司（Invitrogen），反應(yīng)體系參照李博方法［6］。PCR擴增程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃ forever。預(yù)擴增完成后，取5 μL預(yù)擴增產(chǎn)物加水95 μL，稀釋20倍，置于4℃ 備用，其余預(yù)擴增產(chǎn)物在-20℃ 下保存，備用。

1.2.4 選擇性擴增 以稀釋后的預(yù)擴增產(chǎn)物為模板進行選擇性擴增，選擇性擴增采用EcoR I+3/MSeI+2的引物組合，引物同樣合成于上海英駿生物技術(shù)有限公司（Invitrogen），反應(yīng)體系參照李博方法［6］。PCR擴增程序：94℃ 3 min；（94℃ 30 s，65℃ 30 s（-0.7℃ / cycle），72℃ 1 min，13 個循環(huán) ；94 ℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃forever。選擇性擴增后的產(chǎn)物在4 ℃下保存，備用。

表2 AFLP分子標(biāo)記引物信息

1.2.5 電泳及銀染 聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染程序參照李博方法［6］。

1.2.6 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計AFLP 擴增條帶，清晰易于辨認(rèn)的條帶記錄為“1”，空缺時記錄為“0”。應(yīng)用Nei 等［7］方法計算遺傳相似系數(shù)Gs= 2Nij/（Ni+Nj），其中Ni、Nj、Nij分別表示第i個材料的擴增條帶數(shù)、第j個材料的擴增條帶數(shù)、第i和第j個材料擴增的共有條帶數(shù)；利用NTSYS-pc 2.1 軟件按照UPGMA 方法進行聚類分析，繪制聚類圖［8］；選取清晰的AFLP 條帶繪制12個雜種無性系的指紋圖譜。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選

采用EcoR I+3/MseI+2 的引物組合，從32對引物組合中篩選出10 對擴增條帶較多的引物組合對無性系材料進行選擇性擴增。篩選出的10 對引物組合的擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺電泳后得到總條帶數(shù)在7-52 條之間，多態(tài)性條帶數(shù)在2-28 條之間，條帶多態(tài)性比例分布范圍為23.5%-41.6%（表3，圖1）。平均條帶數(shù)最多的引物組合是E51-CTA / M44-TC，共得到52 條。平均條帶數(shù)最少的引物組合為E51-CTA / M38-CT，僅有7 條。多態(tài)性條帶數(shù)最多的引物組合為E40-ATC / M33-AG，共28 條。多態(tài)性條帶數(shù)最少的引物組合為E51-CTA / M38-CT，僅有2條。在所有引物組合中，E51-CTA / M42-GT擴增所得條帶多態(tài)性比例最低，僅為23.5%，而E63-GAA /M33-AG擴增所得條帶多態(tài)性比例最高，為41.6%。

表3 不同引物組合的AFLP 條帶統(tǒng)計

2.2 聚類分析

在所有擴增條帶中，選取83 條AFLP 多態(tài)性條帶，用NTSYS-pc 2.1 軟件按照UPGMA 方法進行聚類分析，繪制了12 份美洲黑楊與大青楊雜種優(yōu)良無性系的親緣關(guān)系樹狀圖（圖2）。從聚類圖中可以看出12 個無性系可以分為3 組，其中136-163 聚為一組，181、183聚為一組，190-193 聚為一組。136、141、146、147、153和163等6 個雜種無性系是美洲黑楊I(lǐng)-69 與大青楊3 號雜交的全同胞子代，具有較近的親緣關(guān)系。聚類結(jié)果顯示該組合內(nèi)又分為3組，其中，136 和153，146、147和163在相似系數(shù)0.82水平上各自聚成一組，然后兩組在0.79 水平上聚為一組。而141 單獨聚為一組，與其它個體在0.74水平上聚為一類。無性系181 和183 是大青楊4 號與美洲黑楊T66 的雜交子代，而無性系190、191、192、193 則是大青楊4 號與美洲黑楊T26 的雜交子代。兩組由于具有共同的母本，在聚類圖上顯示在0.65 水平聚為一起。兩組個體具有相同的母本，但是聚類結(jié)果顯示親緣關(guān)系相對全同胞雜交子代較遠，說明父本的差異對它們的親緣關(guān)系具有一定的影響。

圖1 AFLP選擇性擴增結(jié)果

2.3 遺傳相似系數(shù)分析

圖2 基于AFLP 數(shù)據(jù)的12個雜種無性系聚類圖

根據(jù)10 對引物組合選擇性擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，分析12 個美洲黑楊與大青楊雜種的遺傳相似系數(shù)（表4）。12 份材料由3個雜交組合的子代構(gòu)成，美洲黑楊I(lǐng)-69 與大青楊3 號雜交子代包括無性系136、141、146、147、153和163，這6 個無性系間遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.673 0-0.826 9 之間，平均為0.784 5。大青楊4 號與美洲黑楊T66雜交子代181與183遺傳相似系數(shù)為0.807 6。大青楊4 號與美洲黑楊T26 的雜交子代為190、191、192、193，這4個子代間遺傳相似系數(shù)變化在0.711 5-0.884 6之間，平均0.804 5。3 個組合間，I-69與大青楊3號雜交組合內(nèi)個體平均相似系數(shù)最低，暗示該組合可能相對于其它雜交組合具有更豐富的遺傳變異。在所有個體間，相似系數(shù)最小的是183 與153，為0.173 0，相似系數(shù)最大的是191 與192，為0.884 6。在以大青楊4 號為母本的2 個組合中，183 與190、192的相似系數(shù)最低為0.557 6。這可能是由于不同父本基因組差異造成的。

表4 12個雜種無性系遺傳相似系數(shù)

2.4 指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)選擇性擴增結(jié)果，選擇6 對引物擴增出的9 條多態(tài)性條帶繪制了12 個美洲黑楊與大青楊雜種的指紋圖譜（圖3）。6 對引物組合分別為E40-M33、E51-M38、E51-M40、E51-M44、E51-M56、E60-M34。從圖中可以看出，在該圖譜中每份材料都具有獨特的帶型，從而可以與其他材料互相區(qū)分。

圖3 12個雜種無性系A(chǔ)FLP指紋圖譜

3 討論

利用分子標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜用于鑒別無性系與傳統(tǒng)的表型鑒定方法相比，具有不受環(huán)境干擾、快速準(zhǔn)確等優(yōu)勢。胡曉麗等［9］對12 個三倍體毛白楊和二倍體毛白楊無性系進行AFLP 分子標(biāo)記鑒定，采用EcoR I + 2 /MseI + 3 引物組合，不同引物組合擴增結(jié)果的多態(tài)性比例分布范圍為15.7%-32.4%。本研究采用EcoR I + 3 /MseI + 2 的引物組合，從32對引物組合中篩選出10 對擴增條帶較多的引物組合進行選擇性擴增。多態(tài)性比例最高的引物組合是E63-GAA / M33-AG，為41.6%。多態(tài)性比例最低的引物組合是E51-CTA / M42-GT，為23.5%。本研究結(jié)果顯示，引物擴增多態(tài)性比例相比胡曉麗等人的研究結(jié)果較高，可能是由于擴增引物選擇性堿基數(shù)不同造成的，也可能是本研究選擇的雜交親本具有相對較遠的親緣關(guān)系造成的。

聚類分析結(jié)果顯示所有供試個體被聚為3組，聚類結(jié)果與其系譜關(guān)系完全一致。大青楊4 號作為母本分別與美洲黑楊T66 以及T26 進行雜交，第一個雜交組合包括無性系181 和183，后者包括190、191、192、193 等4 個無性系。聚類圖顯示兩組雜交子代在0.65水平聚為一類，表明兩組個體雖然具有相同的母本，但是聚類結(jié)果顯示親緣關(guān)系相對全同胞雜交子代較遠，說明父本的差異對它們的親緣關(guān)系有較大影響。

李寬鈺等［10］對黑楊派、白楊派和青楊派DNA多態(tài)性的研究結(jié)果顯示白楊派4 個樹種遺傳相似系數(shù)在0.606 9-0.821 5之間，平均為0.662 7。李善文［4］計算得到白楊派全部樣本間平均遺傳相似系數(shù)是0.8273。本研究計算得到了12 份美洲黑楊與大青楊雜種的遺傳相似系數(shù)，數(shù)據(jù)顯示相似系數(shù)在0.173 0-0.884 6之間，平均0.660 4。相似系數(shù)變化范圍與先前研究相比較寬，可能是由于供試材料不同造成的。此外，美洲黑楊I(lǐng)-69 與大青楊3 號雜交組合內(nèi)個體平均相似系數(shù)在3個組合中最低。暗示該組合可能相對于其他雜交組合具有更為豐富的遺傳變異，有利于下一步選擇育種工作的開展。在所有個體間，相似系數(shù)最小的是183 與153，僅為0.173 0，相似系數(shù)最大的是191 與192，為0.884 6。在以大青楊4 號為母本的兩個組合中，183 與190、192 的相似系數(shù)最低，為0.557 6，這可能是由于不同父本基因組差異造成的。

RAPD、AFLP、SSR 等眾多分子標(biāo)記技術(shù)都被用來構(gòu)建指紋圖譜［2，3，11，12］。RAPD 標(biāo)記帶型豐富，但是重復(fù)性較差。SSR 標(biāo)記重復(fù)性好，但是條帶不夠豐富并且引物開發(fā)需要有已知序列，難以推廣到基因組信息未知的樹種。AFLP 標(biāo)記技術(shù)則具有帶型豐富，重復(fù)性好，引物開發(fā)不依賴已知序列等優(yōu)點。胡曉麗［9］與本研究分別使用了3 對和6 對引物即可以分別將試驗所用無性系材料進行準(zhǔn)確區(qū)分和鑒定。因此，相對于其它分子標(biāo)記技術(shù)，AFLP 是構(gòu)建指紋圖譜較好的分子標(biāo)記系統(tǒng)。

4 結(jié)論

本研究采用AFLP標(biāo)記技術(shù)對美洲黑楊與大青楊12個雜種無性系進行分子鑒定，10對引物組合擴增得到總條帶數(shù)在7-52 條之間，多態(tài)性條帶數(shù)在2-28 條之間，條帶多態(tài)性比例分布范圍為23.5%-41.6%；UPGMA 聚類分析將12個無性系在不同水平上聚為3大類，結(jié)果與其系譜關(guān)系一致；根據(jù)6個引物組合的9條多態(tài)性條帶繪制了12個無性系的指紋圖譜。

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