姜 真 孫長崗 莊 靜 劉瑞娟 王華慶 王 興 曲美婷

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年其發(fā)病率呈明顯上升的趨勢［1］。目前普遍認為乳腺癌是基因環(huán)境交互作用的復雜疾病。乳腺癌傳統(tǒng)的治療方法是以手術(shù)切除、輔以放療、化療及內(nèi)分泌治療。隨著人類對惡性腫瘤發(fā)病機制認識的不斷深入和分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，基因治療成為其生物學治療的重要探索方向［2］。p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子（p53up-regulatedmodulatorofapoptosis，PUMA）是近年來報道新發(fā)現(xiàn)的Bcl-2蛋白家族中的促凋亡成員，有強大的促凋亡作用。研究表明PUMA在p53依賴和非依賴途徑的細胞凋亡啟動與腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用，并且比p53的促凋亡作用更強大、穩(wěn)定，因此在近年腫瘤基因治療的研究中受到廣泛關(guān)注［3］。體外實驗表明，轉(zhuǎn)染外源性PUMA基因可以誘導腫瘤細胞的快速凋亡和抑制集落形成，并且PUMA基因轉(zhuǎn)染明顯增加體內(nèi)外食管癌、頭頸細胞癌、絨膜癌、肺癌細胞的化療和放療敏感性，增加治療效果［4-5］。本研究對PUMA基因轉(zhuǎn)染是否增強乳腺癌MCF-7細胞對表柔比星致凋亡的敏感性進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與試劑 PUMA-pCDNA3和pCDNA3購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；鼠抗人PUMA多克隆抗體購自CellSignals公司；G418、LipofectinamineTM2000購自Cibco公司；Western blotting、TUNEL、MTT和小量質(zhì)粒快速抽提純化試劑盒購自上海華舜公司；蛋白質(zhì)分子量標準購自中國科學院上海生物化學研究所。乳腺癌細胞株MCF-7購自中國科學院上海細胞所，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃恒溫、飽和濕度和5%CO2，對數(shù)生長的細胞供實驗使用。

1.1.2 細胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期MCF-7細胞按2×105/孔的密度懸于2 mL完全培養(yǎng)液中，接種在6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，至細胞長至約60%～80%融合。用無血清和無抗生素的培養(yǎng)液沖洗每孔加入2 μL目的基因質(zhì)粒PUMA-pCDNA3或空載體質(zhì)粒pCDNA3和8 μL脂質(zhì)體，然后置于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)5 h。再將培養(yǎng)液換成加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，然后換用G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)（含G4183 mg/mL）進行篩選，3～5 d換液1次，2周后從穩(wěn)定表達的細胞克隆中挑選出多個單細胞克隆繼續(xù)培養(yǎng)。將PUMA-pCDNA3和pCDNA3轉(zhuǎn)染的細胞分別命名為MCF-7/PUMA和MCF-7/pCDNA3。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測PUMA/MCF-7對表柔比星細胞毒性的敏感性 將MCF-7、MCF-7/PUMA和MCF-7/pCDNA3細胞分別接種在96孔培養(yǎng)板（1×104/孔），次日每孔更換含系列濃度表柔比星（0.01、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100 μmol/L）的培養(yǎng)液100 μL。48 h后，每孔加入10 μL的MTT溶液（2.5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h，去除培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的DMSO（Sigma公司），溶解已形成的結(jié)晶，震搖5 min，在波長570 nm處測定光密度值（0D）。設(shè)置空白對照：與實驗孔平行設(shè)置，僅加培養(yǎng)液，檢測時以此為空白調(diào)零。實驗進行3次，結(jié)果取平均值。細胞存活率（%）=（實驗組0D-空白對照0D）/（對照組0D-空白對照0D）×100%。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞的凋亡 將MCF-7、MCF-7/PUMA和MCF-7/pCDNA3細胞各按1×106/孔接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，第2天分別加入1 μmol/L的表柔比星 100 μL常規(guī)培養(yǎng)72h，然后按照說明書加入FITC和PI雙染色，上流式細胞儀檢測。實驗以不加表柔比星作為對照組。結(jié)果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能；細胞膜有損傷的細胞DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細胞凋亡早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴毎c此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-PI-）；右上象限是非活性細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。

1.2.3 TUNEL法測定表柔比星誘導的腫瘤細胞的凋亡 離心重懸各組細胞，接種細胞于內(nèi)置蓋玻片的3.5 cm培養(yǎng)皿（1×108/皿），37℃溫箱孵育24h后加入0.1 μmol/L或1 μmol/L的表柔比星 10 μL繼續(xù)孵育72 h，實驗以不加表柔比星組作為對照。采用TUNEL試劑盒，按試劑盒說明書操作，計算每個高倍視野下凋亡細胞數(shù)，每一個樣本隨機計數(shù)5個視野。

1.2.4 Western blotting檢測腫瘤細胞PUMA蛋白的表達 提取經(jīng)表柔比星或無表柔比星作用72h的細胞總蛋白進行Western blotting檢測。SDS-PAGE上樣量為15 μg/L。SDS電泳：恒流，每塊板20～40 mA，電泳時間約2h。轉(zhuǎn)膜：恒流，每張膜42 mA，時間為3.5h。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理。率的比較采用χ2檢驗。實驗結(jié)果以±s表示，兩個獨立樣本組間均數(shù)比較用t檢驗，多組的組間比較用方差分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 PUMA基因?qū)肴橄侔┘毎鰪妼Ρ砣岜刃侵碌蛲鲎饔玫拿舾行?/h3>

通過MTT法測定了乳腺癌細胞對表柔比星致凋亡作用的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表柔比星的濃度為0.01～100 μmol/L時細胞存活率與表柔比星濃度之間均存在劑量依賴性，隨著表柔比星濃度增高，細胞存活率逐漸下降；與MCF-7和MCF-7/pCDNA3細胞相比，MCF-7/PUMA細胞存活率下降更為明顯。利用Excel軟件計算得出，MCF-7和MCF-7/pCDNA3細胞的IC50分別為（13±1.4）和（10.7±1.3）μmol/L。相比之下，MCF-7/PUMA比MCF-7細胞敏感7.2倍，其IC50為（1.8±0.2）μmol/L（圖1）。由此可見，乳腺癌細胞轉(zhuǎn)染PUMA基因可增加對表柔比星致凋亡作用的敏感性。

圖1 PUMA基因轉(zhuǎn)染增強MCF-7細胞對表柔比星細胞毒作用的敏感性Figure1 PUMA gene transfection in enhancing the sensitivity of MCF-7 cells on pirarubicin cytotoxicity

2.2 MCF-7/PUMA細胞凋亡的FCM檢測結(jié)果

細胞經(jīng)AnnexinV-PI標記后于流式細胞儀上檢測其凋亡情況。細胞凋亡率（圖2）提示：MCF-7細胞的凋亡率為（5.50±1.03）%，作用于表柔比星（1 μmol/L）后MCF-7細胞凋亡率為（18.1±2.13）%，而表柔比星（EPI）作用后MCF-7/PUMA的細胞凋亡率為（52.18±10.2）%，明顯 高 于 MCF-7 組（P＜0.01）和 MCF-7/PUMA組（P＜0.05）。表柔比星作用于MCF-7/pCDNA3后的細胞凋亡率為（18.55±4.32）%，與MCF-7/表柔比星細胞（18.1±2.13）%相比無顯著性差異（P＞0.05），提示PUMA轉(zhuǎn)染增強表柔比星的促細胞凋亡作用。

2.3 MCF-7/PUMA細胞凋亡的TUNEL檢測結(jié)果

0.1 μmol/L的表柔比星作用72h，MCF-7/PUMA細胞的凋亡率為（6.44±1.46）%，MCF-7細胞和MCF-7/pCDNA3細胞凋亡率為（0.9±0.24）%和（1.15±0.26）%。1 μmol/L的表柔比星作用72 h后，各組細胞中均可見凋亡細胞，MCF-7和MCF-7/pCDNA3細胞的凋亡率為（12.6±3.73）%和（15.2±5.17）%，MCF-7/PUMA細胞的凋亡率為（35.47±9.36）%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 PUMA轉(zhuǎn)染和表柔比星作用致乳腺癌細胞PUMA蛋白表達的改變

PUMA轉(zhuǎn)染是否與表柔比星誘導的凋亡有關(guān)，本研究分析了PUMA蛋白的變化。MCF-7細胞含有少量內(nèi)源性PUMA蛋白表達，經(jīng)表柔比星作用后PUMA蛋白表達增加；MCF-7/PUMA細胞被表柔比星作用后，PUMA表達增加更明顯；而MCF-7/pCDNA3細胞表柔比星作用后，PUMA的蛋白表達與MCF-7/表柔比星組相似（圖3）。

圖2 流式細胞儀檢測表柔比星誘導的MCF-7/PUMA細胞的凋亡Figure2 Flow cytometry of pirarubicin-induced apoptosis in MCF-7/PUMA cells

圖3 表柔比星誘導的MCF-7/PUMA細胞PUMA蛋白的表達Figure3 Pirarubicin-induced PUMA protein expression in MCF-7/PUMA cells

3 討論

乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位，隨著人們生活水平的提高，其發(fā)病率也隨之上升并呈低齡趨勢，已成為女性健康的第一殺手。目前主要治療為術(shù)后輔以蒽環(huán)類藥物化療為主。表阿霉素是一種蒽環(huán)類化合物，是臨床上廣譜抗腫瘤抗生素，主要作用是直接嵌入DNA堿基對之間，干擾轉(zhuǎn)錄過程，阻止mRNA的形成，從而達到對腫瘤細胞的殺傷作用［6］。然而，在大多數(shù)腫瘤的化學藥物治療中，含蒽環(huán)類化療方案很多已耐藥或達到心臟毒性累積劑量。乳腺癌的生成是腫瘤細胞增殖及凋亡平衡失調(diào)的結(jié)果，細胞周期失控導致細胞過度增殖，但更重要的是細胞凋亡受阻，直接導致了衰老、受損及異常細胞的生命延長。因此，尋找到一種能夠增加化療藥物敏感性的藥物成為目前研究的熱點。增強蒽環(huán)類藥-表柔比星化療敏感性的方法較多，除了傳統(tǒng)的化療藥物聯(lián)合外，表柔比星聯(lián)合基因治療也是增強表柔比星敏感性的新方法，并取得了明顯的療效。PUMA作為p53下游的凋亡促進基因，在許多腫瘤細胞中表達缺失或低表達［7-10］，增加細胞內(nèi)PUMA表達能顯著促進腫瘤細胞凋亡，并且能顯著增強腫瘤細胞對放化療的敏感性，提示PUMA可以作為化療增敏劑用于腫瘤治療。

本研究觀察PUMA基因轉(zhuǎn)染是否增強MCF-7細胞對表柔比星的治療敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將系列濃度的表柔比星作用于MCF-7/PUMA細胞，PUMA能明顯地增強MCF-7細胞對表柔比星的治療敏感性，降低IC50平均值。進一步分析了表柔比星是否通過誘導細胞凋亡而發(fā)揮作用，結(jié)果表明，0.1 μmol/L的表柔比星僅能誘導轉(zhuǎn)染PUMA的細胞發(fā)生凋亡，而不能誘導MCF-7細胞和載體對照細胞的凋亡；高濃度的表柔比星（1 μmol/L）能誘導全部細胞系的細胞凋亡，但凋亡率在轉(zhuǎn)染PUMA的細胞中明顯高于不轉(zhuǎn)染PUMA的MCF-7細胞和轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7細胞。結(jié)果提示，PUMA能增強表柔比星誘導MCF-7的凋亡作用。細胞內(nèi)PUMA蛋白表達檢測發(fā)現(xiàn)，MCF-7細胞僅含有少量內(nèi)源性PUMA表達，經(jīng)表柔比星作用后PUMA蛋白表達增加，轉(zhuǎn)染PUMA基因的細胞作用表柔比星后，PUMA蛋白表達增加更明顯，所以表柔比星化療敏感性的增強是通過增加PUMA表達實現(xiàn)的。因此，開發(fā)相應(yīng)能導致PUMA激活的DNA元件、轉(zhuǎn)錄因子及其他無毒性的小分子物質(zhì)，利用這些物質(zhì)激活PUMA在腫瘤細胞內(nèi)強表達是增強表柔比星化療敏感性的可行措施，也是乳腺癌治療的新方向。

1 李媛媛,張 斌,趙洪猛,等.PXD101對人乳腺癌細胞MCF-7增殖及凋亡影響的機制探討[J].中國腫瘤臨床,2012,39(5):249-253.

2 馬斌林,耿中利,阿力比亞提·艾尼,等.pcDNA3.0-PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染15dPGJ2對乳腺癌MCF-7細胞體外培養(yǎng)的影響[J].新疆醫(yī)科大學學報,2009,32(7):833-838.

3 Wang R,Wang X,Li B,et al.Tumor-specific adenovirus-mediated PUMA genetransferusingthesurvivin promoterenhances radiosensitivity of breast cancer cells in vitro and in vivo[J].Breast Cancer Res Treat,2009,117(1):45-54.

4 Sun QH,Sakaida T,Yue W,et al.Chemosensitization of head and neck cancer cells by PUMA[J].Mol Cancer Ther,2007,6(12):3180-3188.

5 ChenY,QianH,WangH,etal.Ad-PUMA sensitizes drug-resistant choriocarcinoma cells to chemotherapeutic agents[J].Gynecol Oncol,2007,107(3):505-512.

6 孫 燕,周繼昌,主編.臨床腫瘤內(nèi)科手冊[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1996:348-353.

7 李 昆,李世正,張?zhí)N莉,等.槲皮素對人乳腺癌細胞MDA-MB-435S增殖及侵襲力的影響[J].腫瘤防治研究,2009,36(7):549-551.

8 宋俊穎,張麗娜,鄭 紅,等.凋亡抑制基因AVEN mRNA在乳腺癌中的表達差異[J].中國腫瘤臨床,2012,39(4):197-200.

9 劉 鋒,孫 根,何 川,等.siRNA沉默c-FLIP基因表達與表柔比星聯(lián)合應(yīng)用對MCF-7細胞凋亡的影響[J].實用腫瘤學雜志,2010,24(4):337-340.

10 周云海,周士福.乳腺癌COX-2表達與紫杉醇脂質(zhì)體聯(lián)合表柔比星新輔助化療療效關(guān)系的研究[J].臨床腫瘤學雜志,2010,15(5):435-437.