胡麗萍，陸紅，白永恒，王斯璐，洪煒龍，林成成，梁勇，林向陽

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.醫(yī)學檢驗中心；2.外科實驗室）

近年來，有關(guān)服用中草藥導致的腎臟損害屢見報道，馬兜鈴酸（aristolochic acid，AA）就是其中之一。在體內(nèi)，AA引起損傷的主要病理表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤、腎小管上皮細胞凋亡和壞死以及間質(zhì)纖維化等[1]。目前AA致腎間質(zhì)纖維化的分子機制尚不明確。我們前期研究顯示，TGF-β1可能在AA誘導腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮重要作用[2-3]。最近研究顯示，GTPase Rho家族某些成員在調(diào)控TGF-β1中具有重要作用[4]。本研究擬通過體外實驗觀察AA對腎小管上皮細胞的損傷作用，同時探究GTPase Rho的重要成員Rac1蛋白在AA損傷小管上皮細胞過程中可能的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 AA（美國Sigma公司）；DMEM細胞培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶和TRIzol提取液（美國Gibco公司）；WST-1和Hoechst 33258染色液（上海碧云天公司）；兔抗鼠Rac1抗體（美國Santa Cruz公司）；兔抗鼠III型膠原抗體（Bioworld公司）；Rac1和TGF-β1 ELISA檢測試劑盒（上海西唐生物）；RT-PCR試劑（美國Promega公司）；MYCYCLER梯度PCR儀（美國BIOROD公司）；7500定量PCR儀（美國Applied Biosystens公司）；Varioskan Flash全波長多功能掃描儀（美國Thermo Scientific公司）；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。NRK-52E細胞在含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取細胞接種于6孔板中，待細胞70%～80%融合時，在培養(yǎng)液中加入AA，對照組加入含有等量溶劑的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化。

1.2.2 WST-1法檢測細胞增殖抑制率：取對數(shù)生長期的NRK-52E細胞，用胰酶消化，調(diào)整細胞密度為5×107/L，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL培養(yǎng)液。待細胞貼壁后，實驗組每孔加入濃度為5、10、20、50和100μg/mL的AA，并設6個平行孔，作用24 h，對照組加溶劑；另外，在保持AA作用濃度為10μg/mL的情況下，分別作用24、48和72 h。培養(yǎng)結(jié)束前2 h每孔加入10μL WST-1溶液，培養(yǎng)結(jié)束后于全波長多功能掃描儀上測量450 nm主波長和690 nm副波長的吸光度值（A值），實驗重復3次。按公式計算AA對NRK-52E細胞增殖的抑制率：細胞增殖抑制率（%）=1-（實驗組A450值－空白組A690值）/（對照組A450值－空白組A690值）×100%。

1.2.3 Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡：將預處理的潔凈蓋玻片置于6孔板內(nèi)，接種細胞培養(yǎng)過夜，當細胞密度達到70%～80%時，分別加入AA藥物1μg/mL和10μg/mL作用24 h，移去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定10 min，棄固定液，PBS洗兩次，Hoechst 33258染液染色5 min，去染色液，PBS洗兩次，吸盡液體。滴加抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，熒光顯微鏡觀察，并隨機選取位置拍照。

1.2.4 real-time RT-PCR檢測TGF-β1 mRNA的表達：采用Trizol試劑提取已處理細胞中的RNA，于260/280 nm測定吸光度值以確定樣本純度和濃度。根據(jù)試劑說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。應用Primer 5.0軟件設計TGF-β1 mRNA的特異性引物，以β-actin作為內(nèi)參，引物由上海生工公司合成。引物序列為TGF-β1：5’-AGGCGGTGCTCGCTTTGT-3’（正向）和5’-GATTGCGTTGTTGCGGTCC-3’（反向）；β-actin：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’（正向）和5’-TTTAATGT CACGCACGATTTC-3’（反向）。PCR擴增體系：5μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、2μL引物（上、下游各1μL，終濃度200 nmol/L）、2μL反應緩沖液、1 μL cDNA。PCR程序為：95 ℃ 3 min預變性，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個循環(huán)。采用相對定量法計算獲得結(jié)果，溶解曲線分析結(jié)果的可靠性。相對表達量=2－△△Ct，ΔΔCt=［Ct目的基因（待測樣品）-Ct內(nèi)參照（待測樣品）］－［Ct目的基因（校正樣品）－Ct內(nèi)參照（校正樣品）］。

1.2.5 ELISA法檢測Rac1和TGF-β1蛋白含量：取對數(shù)生長期的NRK-52E細胞，分別以1、5、10μg/mL AA作用24 h，收集培養(yǎng)液。Rac1和TGF-β1含量檢測采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，嚴格按照Rac1和TGF-β1 ELISA檢測試劑盒說明書進行操作。采用BCA法進行蛋白定量，根據(jù)與總蛋白比值繪制標準曲線。

1.2.6 細胞免疫熒光檢測III型膠原和Rac1含量：將預處理的潔凈蓋玻片置于6孔板內(nèi)，接種細胞培養(yǎng)，待細胞貼壁后，加入AA藥物10μg/mL作用24 h。輕輕取出細胞爬片放到用過的細胞培養(yǎng)皿里，PBS洗3次，4%冷的多聚甲醛固定20 min，棄固定液，PBS洗3次；0.2% Triton X-100通透10 min，PBS洗3次；血清封閉30 min，PBS洗3次；加一抗，4 ℃濕盒內(nèi)過夜，PBS洗3次；加二抗，37 ℃濕盒內(nèi)1 h，PBS洗3次，甘油封片，照熒光片。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果以 ±s表示，兩樣本比較采用成組t檢驗，相關(guān)分析采用pearson分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 WST-1法檢測AA對NRK-52E細胞的增殖抑制率

結(jié)果顯示，保持AA作用24 h情況下，隨著AA濃度增加，細胞增殖抑制率明顯增加；保持AA 10μg/mL作用濃度不變的情況下，隨著作用時間的延長，AA對細胞的增殖抑制率明顯增加，提示AA抑制NRK-52E細胞增殖具有濃度和時間的依賴性，見圖1。

圖1 AA對NRK-52E細胞增殖的抑制情況

2.2 Hoechst 33258染色觀察AA對NRK-52E細胞凋亡的作用 與對照組細胞相比，AA 1μg/mL干預組的細胞出現(xiàn)凋亡小體，AA 10μg/mL干預組的細胞凋亡特征更明顯，且細胞數(shù)量明顯減少，提示AA能誘導腎小管上皮細胞凋亡，且在作用時間相同的情況下，高濃度AA誘導凋亡的作用更顯著，見圖2。

圖2 Hoechst 33258染色檢測AA誘導大鼠NRK-52E細胞凋亡（×400）

2.3 AA對腎小管上皮細胞膠原累積的影響 細胞免疫熒光及其相對定量結(jié)果顯示，與對照組相比，10μg/mL AA作用NRK-52E細胞后，細胞外基質(zhì)成分III型膠原的表達明顯增多（P＜0.05），提示腎小管上皮細胞出現(xiàn)纖維化樣改變，見圖3。

圖3 細胞免疫熒光檢測AA誘導大鼠NRK-52E細胞表達III型膠原情況

2.4 AA促進促纖維化因子TGF-β1 mRNA和蛋白的表達 ELISA法檢測結(jié)果顯示，5μg/mL和10μg/mL AA作用24 h后，TGF-β1的表達量較對照組明顯升高（P＜0.05）；real-time RT-PCR結(jié)果也顯示，10 μg/mL AA干預組中TGF-β1 mRNA的表達量較對照組明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組間TGF-β1蛋白和mRNA以及Rac1蛋白表達量比較（ ±s）

2.5 AA影響腎小管上皮細胞分泌Rac1蛋白 ELISA法檢測結(jié)果顯示，不同濃度AA作用NRK-52E細胞后，Rac1蛋白的表達均升高；細胞免疫熒光染色結(jié)果也顯示AA促進了小管上皮細胞分泌Rac1蛋白，見表1和圖4。

圖4 Rac1在AA損傷腎小管上皮細胞過程中的表達改變

2.6 Rac1蛋白與TGF-β1的相關(guān)性分析 采用Pearson法分析上清液中Rac1和TGF-β1蛋白含量的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rac1和TGF-β1含量存在明顯正相關(guān)關(guān)系（r=0.967，P=0.007）。

3 討論

AA是硝基菲類有機酸化合物，在中藥馬兜鈴、廣防己、關(guān)木通和中成藥龍膽瀉肝丸、當歸四逆丸、大黃清胃丸等中均有檢出。使用AA類藥物能引起廣泛的腎間質(zhì)纖維化，進而引起急慢性腎功能衰竭，即馬兜鈴酸腎病。然而，目前對AA誘發(fā)腎間質(zhì)纖維化機制的認識尚不清楚，大致涉及以下幾方面[5]：胞質(zhì)毒學說、腎缺血學說、細胞凋亡學說、腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化學說。我們的研究顯示，AA作用于腎小管上皮細胞，可抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡?？赡艿臋C制之一為AA導致DNA損傷和細胞周期阻滯于G2/M期，從而誘導細胞凋亡[6]。除了誘導腎小管上皮細胞凋亡外，我們還發(fā)現(xiàn)AA可促進III型膠原的表達，引起纖維化樣改變。對于這種現(xiàn)象，Yang等[6]認為AA刺激JNK信號通路的活化，進而誘發(fā)TGF-β1的表達是主要因素。而我們的研究顯示，AA損傷腎小管上皮細胞不僅表現(xiàn)為TGF-β1表達的上調(diào)，同時還伴有Rac1蛋白的高表達，提示Rac1蛋白很可能也是AA引起纖維化樣改變的一個重要分子機制。

Rho蛋白為小分子鳥苷酸結(jié)合蛋白（又稱小G蛋白），是Ras蛋白超家族成員。Rac蛋白是Rho家族小G蛋白的成員之一，有Rac1、Rac2、Rac3三種同工形式。Rac1和Rac3在體內(nèi)廣泛分布，而Rac2是一種造血細胞特異的小G蛋白[7]。TGF-β1是一種多功能細胞因子，可通過其蛋白激酶受體介導包括形態(tài)發(fā)生、胚胎發(fā)育、干細胞分化、炎癥調(diào)節(jié)及傷口愈合在內(nèi)的一系列生物過程，同時還能促進膠原累積，參與纖維化進程[2，8]。TGF-β1參與纖維化形成主要是與其受體結(jié)合，激活下游Smad復合體，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，即通過經(jīng)典的Smad信號通路發(fā)揮作用[9]。除此之外，TGF-β1還可通過ERK-MAPK信號通路、GTPase Rho等發(fā)揮促纖維化功能[4，10]。Rac1作為GTPase Rho家族成員之一，也可能參與TGF-β1促腎纖維化的進程。已有研究表明，TGF-β1的高表達能活化Rac1介導的ERK通路，從而導致腎纖維化[10]。

但是，不同的Rho亞型在膠原累積過程中的作用可能不一樣[11]。那么本研究中，Rac1蛋白在腎纖維化進程中到底發(fā)揮著怎樣的作用？我們同時檢測了Rac1蛋白和促纖維化因子TGF-β1的表達，并分析兩者相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)AA作用腎小管上皮細胞后，促纖維化因子TGF-β1和III型膠原表達明顯增加，Rac1蛋白表達也增加，且與TGF-β1存在明顯正相關(guān)關(guān)系，提示Rac1在AA所致腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮正調(diào)控作用?？赡艿臋C制是AA損傷腎小管上皮細胞的情況下，Rac1及其介導的下游通路如ERK等，被TGF-β1表達和釋放的增加所活化，進一步促進小管上皮細胞分泌表達膠原蛋白，出現(xiàn)纖維化反應。

綜上所述，AA誘導膠原累積過程中，伴有Rac1蛋白的高表達，說明Rac1蛋白可能參與了纖維化過程。然而，Rac1蛋白及其相關(guān)信號通路在AA所致纖維化病變中的具體功能和定位，還需進一步的研究加以闡釋。干預Rac1蛋白的表達可能成為AA致腎間質(zhì)纖維化治療的新途徑。

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