楊小敏，徐曉武，郭群，袁吟迅，陳艷梅，潘丹

（1.溫州市人民醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 腫瘤外科，浙江溫州 325027）

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多基因改變的過程，受多基因調(diào)控[1]。近來研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素受體β1（TRβ1）在抑制腫瘤方面起重要作用。在肝臟、乳腺[2]等部位的癌組織都發(fā)現(xiàn)TRβ1表達異常。目前對TRβ1、β連環(huán)蛋白（β-catenin）與胃癌各臨床指標相關性的研究較少。本研究通過SP法和RT-PCR技術檢測胃癌組織中TRβ1和β-catenin的表達情況，并分析兩者與臨床病理指標的關系，探討其在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，為判斷預后及指導臨床治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標本來源 收集2010年1月-2012年6月在我院行手術治療的胃癌手術標本80例，其中男45例，女35例，年齡30～85歲，平均（58.3±11.6）歲。高、中分化腺癌22例，低分化腺癌58例。所有病例術前均未進行化療或放療。無癌胃黏膜40例，取自上述胃癌標本距癌組織10 cm以上的切緣，經(jīng)石蠟切片證實無癌浸潤。所有標本均經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片厚4μm，均經(jīng)病理確診。1.2 方法

1.2.1 免疫組化主要試劑及染色：TRβ1（Clone J51；Santa Cruz）、β-catenin（Sigma）；SP 二步法染色試劑盒購自基因科技有限公司。操作步驟如下：烤片，68 ℃，30 min。4μm石蠟切片脫蠟水化，PBS洗滌3次；3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶15 min，pH 8.0的EDTA緩沖溶液高溫高壓抗原熱修復2.5 min；PBS洗滌3次，分別滴加一抗（TRβ1）或β-catenin抗體（稀釋度分別為1:50、1:200，PBS稀釋），4 ℃過夜孵育。過夜孵育后室溫再孵育30 min，PBS洗滌3次，滴加通用型二抗室溫孵育30 min；PBS洗滌3次后DAB顯微鏡下控制顯色，蘇木素復染細胞核，水洗藍化后乙醇脫水，中性樹膠封片。

1.2.2 結果判斷：根據(jù)其細胞內(nèi)分布特征，分別作如下界定：TRβ1陽性染色為胞核淺棕色至深棕色，H-score法[3]依據(jù)陽性細胞的百分比和染色強度（1+，2+，或3+）的乘積之和計算總分，即H=（%1+）×1+（%2+）×2+（%3+）×3，如果切片染色評分H≤0.1（＜10% 細胞呈輕微陽性）判定為陰性，如果H＞0.1判定為陽性。β-catenin陽性染色為細胞膜或細胞漿出現(xiàn)棕黃色細小顆粒，參照文獻[4-5]，將染色記為0～3分：細胞膜、細胞漿均未染色為0分；細胞漿染色為主為1分；異質(zhì)性染色（細胞膜、細胞漿混合染色）為2分；連續(xù)的細胞膜染色為3分。細胞如果無連續(xù)的細胞膜染色被視為異常，即0～2分為陽性表達。

1.3 RT-PCR技術檢測TRβ1和β-catenin mRNA表達 Trizol總RNA抽提純化及RT-PCR試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。TRβ1及β-catenin的引物經(jīng)Gene Bank檢索，利用Primer5.0軟件設計，引物購自北京三博遠志生物技術有限公司。TRβ1上游引物5’-TACTTAGACAAGGACGAGC-3’，下游引物5’-GTAATCCAGCACCAAATC-3’，產(chǎn)物305 bp；βcatenin上游引物5’-GGGCGGCACCTTCCTACTTC-3’，下游引物5’-AGCTCCCTCGCGGTTCAT-3’，產(chǎn)物128 bp。β-actin上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，產(chǎn)物498 bp。退火溫度分別為53、57、53.5 ℃。反應條件均為94 ℃ 預變性4 min 30 s；94 ℃變性30 s，72 ℃延伸3 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。β-actin作為內(nèi)參。PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察并應用Gel-Pro 4400凝膠分析系統(tǒng)進行電泳圖像采集；應用Gel-Pro analyzer軟件對TRβ1、β-catenin及β-actin PCR產(chǎn)物進行光密度值分析，根據(jù)胃癌組及無癌胃黏膜組TRβ1或β-catenin與β-actin光密度的比值標示TRβ1和β-catenin mRNA相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較用Scheffe檢驗法，計數(shù)資料用x2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TRβ1蛋白的表達 無癌胃黏膜組織細胞核染色呈強陽性，偶爾胞漿也著色（見圖1a）； 胃癌組織細胞核染色呈陰性或弱陽性（見圖1b）。胃癌組織TRβ1的陽性表達率明顯低于無癌胃黏膜組織（P＜0.01），陽性表達率分別為16.25%（13/80）、80.00%（32/40）。

圖1 TRβ1蛋白在無癌胃黏膜和胃癌組織中的表達（SP法，×200）

2.2 β-catenin的異常表達 無癌胃黏膜組織βcatenin表達幾乎全部定位于細胞膜上，僅有個別標本細胞漿有弱染色，未見細胞核表達，異常表達率為0（見圖2a）。胃癌組織中細胞膜表達顯著減少，細胞漿表達明顯增加，異常表達50例，陽性率為62.50%（50/80）（見圖2b），兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖2 β-catenin蛋白在無癌胃黏膜組織和胃癌組織中的表達（SP法，×200）

2.3 TRβ1和β-catenin mRNA的表達 TRβ1 mRNA在無癌胃黏膜組織的表達量高于胃癌組織 ，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；β-catenin mRNA的表達量則呈現(xiàn)相反的趨勢，即在胃癌組織中的表達量要高于無癌胃黏膜組織（P＜0.01）。見圖3、表1。

圖3 TRβ1和β-catenin mRNA表達電泳圖

表1 TRβ1和β-catenin mRNA在胃癌組織和無癌胃黏膜組織中的表達（±s）

表1 TRβ1和β-catenin mRNA在胃癌組織和無癌胃黏膜組織中的表達（±s）

與胃癌組織比：aP＜0.01

組織胃癌組織無癌胃黏膜組織n 80 40 TRβ1 mRNA 0.16±0.04a 0.61±0.21a β-catenin mRNA 0.68±0.22a 0.39±0.16a

2.4 TRβ1和β-catenin mRNA表達與臨床病理指標的關系 TRβ1 mRNA表達水平在細胞分化程度低、淋巴結轉移、腫瘤浸潤T3～T4及TNM分期III～IV期患者的腫瘤組織中較細胞分化程度較高、無遠處淋巴結轉移、腫瘤浸潤T1～T2及TNM分期I～II期患者顯著降低（P＜0.05），β-catenin mRNA則相反（P＜0.05）。而兩者與患者性別、年齡及腫瘤大小均無關（P＞0.05），見表2。

3 討論

Guigon等[6]研究表明，TRβ能與T3結合，使βcatenin和TRβ復合體之間的相互作用減弱，從而使β-catenin游離，隨后β-catenin通過GSK3β調(diào)解途徑或p53誘導途徑降解。突變的TRβ也能與βcatenin形成復合體，但是失去了與T3結合的功能，因此即使存在T3，β-catenin也不能從復合體解離，使得β-catenin不能及時降解，從而引起細胞內(nèi)βcatenin大量蓄積。β-catenin作為Wnt/β-catenin信號通路的第二信使，是Wnt信號通路的核心成分。β-catenin在細胞質(zhì)內(nèi)的聚積不僅是Wnt通路激活的標志，還成為惡性腫瘤中的常見事件之一[7]。在正常情況下，β-catenin在細胞膜中表達，細胞質(zhì)中很少表達。若細胞質(zhì)內(nèi)β-catenin含量升高，會導致細胞核內(nèi)含量增多，促使下游靶基因，如CyclinDl和c-myc等的持續(xù)激活，最終加強了細胞增殖活性。

表2 TRβ1和β-catenin mRNA表達與臨床病理指標的關系（±s）

表2 TRβ1和β-catenin mRNA表達與臨床病理指標的關系（±s）

臨床病理指標性別n TRβ1P β-catenin P男 女57 23 0.15±0.037 0.17±0.052 0.6010.68±0.25 0.67±0.23 0.62 47 33 0.15±0.040 0.16±0.045 0.8080.69±0.23 0.67±0.21 0.35 22 58 0.20±0.035 0.14±0.025年齡（歲）≥60＜60分化程度高、中低腫瘤大小（cm）≤3＞3浸潤深度T1～T2 T3～T4 TNM分期I～II III～IV淋巴結轉移0.0060.62±0.19 0.73±0.26 0.004 38 42 0.16±0.120 0.16±0.042 0.9050.69±0.24 0.67±0.21 0.38 17 63 0.20±0.043 0.14±0.028 0.0240.65±0.21 0.71±0.25 0.012 28 52 0.19±0.036 0.13±0.022 0.0070.63±0.22 0.72±0.26 0.01無 有15 65 0.20±0.037 0.14±0.028 0.0110.63±0.23 0.73±0.28 0.006

本研究通過免疫組化SP法檢測TRβ1和β-catenin蛋白在胃癌組織和無癌胃黏膜組織中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織TRβ1的陽性表達率明顯低于無癌胃黏膜組織（P＜0.01），陽性表達率分別為16.25%、80.00%。無癌胃黏膜組織β-catenin表達幾乎全部定位于細胞膜上，僅有個別細胞漿有弱染色，未見細胞核表達，異常表達率為0。胃癌組織中細胞膜表達顯著減少，細胞漿表達明顯增加，異常表達率為62.50%，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

為了進一步證實TRβ1和β-catenin在胃癌組織和無癌胃黏膜組織中的表達情況，本研究又采用RT-PCR法對兩者的mRNA含量進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，TRβ1 mRNA在無癌胃黏膜組織中的表達量高于癌組織（P＜0.05），β-catenin mRNA的表達量則呈現(xiàn)相反的趨勢，即在癌組織中的表達量要高于無癌組織（P＜0.05）。

結合以往及本研究結果，推測在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中有可能也發(fā)生了TRβ1突變，導致正常TRβ1 mRNA及其蛋白表達下降。突變的TRβ1使β-catenin得不到及時降解，使其在細胞內(nèi)大量蓄積，導致下游靶基因的持續(xù)激活，從而引起細胞持續(xù)增殖。

有關TRβ1、β-catenin與腫瘤的臨床病理特性關系的研究較少。有研究表明，兩者與淋巴結轉移、臨床分期等有關[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)TRβ1和β-catenin mRNA的表達量與腫瘤的分化程度、有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度及TNM 分期有關（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤大小無關（P＞0.05），這可能是由于TRβ1的突變致使β-catenin在細胞膜中表達減少，從而使細胞失去黏附功能導致細胞分散，癌細胞表型改變獲得高侵襲性，易于發(fā)生浸潤與轉移[10]。

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