洑香香，周曉東，劉紅娜

（南京林業(yè)大學(xué) 森環(huán)院，江蘇 南京 210037）

山茱萸種子休眠機理與解除方法初探

洑香香，周曉東，劉紅娜

（南京林業(yè)大學(xué) 森環(huán)院，江蘇 南京 210037）

山茱萸種子具深休眠特性，在自然條件下需2年才開始萌發(fā)。本研究用500 mg·L-1GA3分別浸泡山茱萸種子3 d和5 d，結(jié)合不同層積處理（變溫（5～30℃）層積）、低溫層積（0～5℃）、低溫層積1個半月后轉(zhuǎn)入變溫層積），以探索解除種子休眠的方法；并對層積前后的種子進行解剖比較研究。結(jié)果表明：GA3和層積處理都可促進種子休眠的解除；層積3個月的結(jié)果表明變溫層積解除休眠的效果最好，低溫層積+變溫層積次之，低溫層積無效果，但低溫層積7個月可使發(fā)芽率達(dá)到40%；GA3浸泡結(jié)合層積處理可有效解除種子休眠。處理前后種子的解剖結(jié)構(gòu)變化表明：種子的休眠原因既有種皮的機械束縛作用（物理休眠），同時還存在胚的形態(tài)休眠。因此山茱萸種子的休眠屬于復(fù)雜的多因素綜合休眠。

山茱萸；種子休眠；GA3；層積處理; 解剖結(jié)構(gòu)

山茱萸Cornus officinalis具有極好的觀賞性，作為一種新的彩色美化樹種被逐步認(rèn)可。山茱萸先花后葉，花色金黃，似臘梅、迎春和連翹；花期1～3月份：長江以南地區(qū)在春節(jié)前后，黃河、淮河及以北地區(qū)在春節(jié)期間，北京及以北地區(qū)在元宵節(jié)期間即次第開放；花期長達(dá)50 d，料峭春寒，分外妖嬈。因山茱萸具有花期早、花期長、花干性耐寒的特點，是極具市場開發(fā)潛力的年宵花；秋果紅色至紫紅色，簇果如珠，緋紅欲滴，艷麗悅目，是秋冬著名的觀果佳品。

山茱萸屬生長緩慢、結(jié)果遲、壽命長的樹種。實生苗在天然狀態(tài)下7～10年才能開花結(jié)實，人工栽培條件下5～6年可正常開花但不結(jié)實，8～9年后多數(shù)植株掛果[1]。種子具深休眠習(xí)性，需層積一年以上才能大量萌發(fā)[2]。由于山茱萸繁殖能力的限制，嚴(yán)重影響了其在園林市場的推廣和應(yīng)用。本研究對種子采用不同的處理方法，旨在短時間打破休眠并初步探討種子休眠的原因，為生產(chǎn)上規(guī)?；缣峁┘夹g(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

種子材料來自于安徽黃山，果實采收于2010年10～11月份，采收后搓去果肉，淘洗干凈后晾干，于0～4℃下濕沙保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理

層積前將種子用濃度為500 mg·L-1GA3在25℃條件下分別浸泡3 d和5 d，每天換液一次；對照用蒸餾水浸泡。將預(yù)處理的種子與濕沙以1∶3進行混合并進行層積處理。層積處理設(shè)3個溫度：變溫層積（5～30℃）、低溫層積（0～5℃）、低溫層積1個半月后轉(zhuǎn)入變溫層積（見表1）。層積期間管理注意保持通氣，并用500 mg·L-1GA3溶液澆灌、對照用水澆灌，以保持濕潤。

表1 山茱萸種子處理試驗Table 1 Processing test of C. officinalis seed dormancy

1.2.2 發(fā)芽測定

層積處理至種子開始露白時，取樣測定發(fā)芽率。發(fā)芽測定采用3個重復(fù)，每個重復(fù)50粒種子。發(fā)芽條件：種子置于沙床在光照培養(yǎng)箱中進行，發(fā)芽溫度為20～30℃，光照為白天8 h。種子發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)參照《林木種子檢驗規(guī)程》（GB 2772-1999）的規(guī)定，每隔3 d計數(shù)一次，發(fā)芽持續(xù)時間為1個月。

發(fā)芽率：在規(guī)定發(fā)芽天數(shù)內(nèi)正常發(fā)芽的種子粒數(shù)占供試種子粒數(shù)的百分比；

發(fā)芽勢：日發(fā)芽粒數(shù)達(dá)到高峰時正常發(fā)芽種子數(shù)占供檢種子數(shù)的百分率。

發(fā)芽持續(xù)時間：根據(jù)《林木種子檢驗規(guī)程》（GB 2772-1999）[3]的規(guī)定，以連續(xù)3天每天的發(fā)芽率不超過重復(fù)粒數(shù)的1%為結(jié)束發(fā)芽。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

統(tǒng)計種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢，采用Excel軟件對測定數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山茱萸種子萌發(fā)特性

2.1.1 種子的萌發(fā)進程

以用500 mg·L-1GA3浸泡5 d、并置于低溫條件下層積7個月來闡述種子的發(fā)芽進程。

圖1 山茱萸種子萌發(fā)進程Fig.1 Germination process of C. officinalis seeds

由圖1可知：在持續(xù)1個月的發(fā)芽時間內(nèi)，合計發(fā)芽率為40%。置床后第9 d出現(xiàn)了發(fā)芽高峰（發(fā)芽率達(dá)到9%），發(fā)芽勢為19%。萌發(fā)過程中發(fā)芽情況相對平穩(wěn)，這和田間表現(xiàn)一致，即在田間發(fā)芽持續(xù)時間可長達(dá)6個月。由此可知，山茱萸種子由于其深休眠特性，解除休眠也較為緩慢，在萌發(fā)過程中沒有明顯的發(fā)芽高峰。

一般認(rèn)為，發(fā)芽勢越高種子活力強,發(fā)芽迅速、整齊，幼苗生產(chǎn)潛力大，幼苗間個體差異小，并有利于田間管理。但是山茱萸種子的發(fā)芽勢在本試驗中最高僅達(dá)19%，可能由于種子未完全解除休眠，因而種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均不太高。

2.2 GA3處理對種子萌發(fā)的影響

植物激素處理對解除種子休眠（尤其是生理性休眠）的效果顯著。由表2可以看出（層積3個月），GA3處理可以明顯促進山茱萸種子的萌發(fā)。單因素方差分析和多重比較分析表明（表2），GA3處理3 d和5 d的種子發(fā)芽率均與對照差異顯著，但前兩者之間差異不顯著，說明GA3處理明顯促進了山茱萸種子的萌發(fā)，但處理時間長短對解除休眠的效果不顯著。

2.3 層積溫度對解除山茱萸種子休眠的效果

層積是常用的有效打破種子休眠的方法，尤其對因含抑制物質(zhì)如ABA等而形成生理休眠（PD）的種子效果顯著，同時也可有效解除物理休眠（PY）類種子[4]。

表2 GA3浸泡山茱萸種子的發(fā)芽率及比較?Table 2 Germination percentage of C. officinalis seeds treated with GA3 and stratification

由表3可知，層積處理3個月時種子發(fā)芽率差異很大。變溫層積效果最好，發(fā)芽率可達(dá)36%；低溫層積1個半月后轉(zhuǎn)入變溫層積的發(fā)芽率次之，僅達(dá)9%；而低溫層積3個月種子的發(fā)芽率為0，說明種子仍處于休眠狀態(tài)。

方差分析表明，不同層積處理間種子的發(fā)芽率達(dá)差異極顯著水平（p＜0.01）。由此可見層積處理對山茱萸種子萌發(fā)有顯著的促進作用。多重比較顯示低溫處理、變溫和低溫+變溫處理差異達(dá)極顯著水平，而后兩者間的差異達(dá)顯著水平。說明變溫層積在解除山茱萸種子的休眠中起了更為重要的作用，相比較而言，低溫層積的作用則小一些。

表3 層積處理3個月對山茱萸種子休眠解除的影響?Table 3 Effects of stratification for 3 months different temperatureon C. officinalis seeds releasing dormancy

2.4 GA3浸泡結(jié)合層積處理對解除種子休眠的綜合影響

為了分析激素處理（時間）和層積溫度對解除種子休眠的綜合影響，本研究對用500 mg·L-1GA3分別浸泡3、5 d的種子在變溫、低溫+變溫和低溫條件下層積3個月進行綜合分析（見表4）。由表可見，僅從發(fā)芽情況看，GA3浸泡3 d并在變溫條件下層積的發(fā)芽效果最好，可達(dá)36%，但該處理在低溫+變溫層積的效果較差，發(fā)芽率只有12%；GA3浸泡5 d的種子在變溫、低溫+變溫條件下層積的效果相似，發(fā)芽率都達(dá)到17%；對照（清水處理）、GA3浸泡后在低溫下層積在3個月對解除休眠的效果不顯著。

表4 GA3結(jié)合層積處理山茱萸種子的發(fā)芽率Table 4 Germination percentage of C. officinalis seeds after stratification and GA3 treatments

方差分析表明（表5），GA3處理的時間、層積方法及二者的交互作用都對種子的發(fā)芽率的影響達(dá)到了極顯著水平。由此可見，GA3處理和層積方法分別在一定程度上能解除種子休眠，從交互效應(yīng)的影響效果看，二者結(jié)合處理可加速解除種子的休眠。

表5 預(yù)處理對種子發(fā)芽率影響方差分析Table 5 Variance analysis of effect of pretreatment on seed germination

2.5 山茱萸種子休眠原因初探

為了進一步探討山茱萸種子的休眠原因，本研究把預(yù)處理前后的種子進行解剖比較，以期找出山茱萸種子的休眠原因。

從種子的橫切圖（如圖2）可看出，明顯可見胚、胚乳和骨質(zhì)種皮結(jié)構(gòu)。最為明顯的是種皮厚度與整個胚腔直徑相近，且種皮中鑲嵌一圈蜂窩狀的分泌組織，內(nèi)含黃色的粘性油狀物質(zhì)，管康林等[2]認(rèn)為這些粘性物質(zhì)主要為單寧類物質(zhì)。種皮主要是由角質(zhì)層細(xì)胞、石細(xì)胞和上述分泌組織組成。劉雅帥[5]則發(fā)現(xiàn)種皮的角質(zhì)層細(xì)胞和石細(xì)胞排列緊密，影響了種子的透氣和透水作用；同時認(rèn)為單寧類粘性油狀物質(zhì)對種子的萌發(fā)具有抑制作用。種子經(jīng)層積處理后種皮軟化，油狀物質(zhì)逐漸消失（解剖過程中的粘性感消失）。由此推測山茱萸種子種皮的機械障礙及種皮內(nèi)抑制物質(zhì)的存在是種子休眠的主要原因之一。

從橫切圖上（種子的1/2處切）可見，層積前種胚直徑D（圖2-A）約為胚腔直徑的1/2，胚的橫斷面（推測應(yīng)是胚軸的橫斷面）僅約占胚腔的1/4；經(jīng)過層積處理后（圖2-B）胚直徑D約達(dá)到胚腔直徑的3/4以上。從縱切圖上看，層積前（圖3-C）明顯可見胚體的長度約為胚腔長度的1/2～3/4，而經(jīng)過層積處理后胚體的長度基本上充滿了整個胚腔（圖3-D），由此可見，山茱萸種子還存在胚的形態(tài)休眠，即種子成熟時，胚還未完成生長；經(jīng)過GA3浸泡的種子在層積過程中種胚長大，從而完全生理后熟，并促進種子萌發(fā)。

圖2 層積前后種子橫切面：示胚橫向的變化（A:層積前，B: 層積后）Fig.2 Transverse sections of C. officinalis seeds before and after stratification ( A: before stratification; B: after stratification)

圖3 層積前后種子縱切面：示胚縱向的變化（C:層積前；D:層積后）Fig.3 Longitudinal sections of C. officinalis seeds before and after stratification (C: before stratification; D: after stratification)

3 討 論

種子休眠特性是植物對環(huán)境條件的生物學(xué)適應(yīng)，對植物本身是一種保護，但也給林木種苗生產(chǎn)帶來了困難。種子休眠過深，會導(dǎo)致田間出苗率降低，出苗參差不齊，同時也會造成種子的大量浪費，因此采取相應(yīng)的措施解除種子休眠，具有重要的生產(chǎn)實踐意義。

3.1 激素與休眠

對于大部分的休眠類種子中，涉及到2種激素，一是脫落酸（ABA），二是赤霉素（GA）。一般認(rèn)為，在種子的成熟過程中種子內(nèi)的ABA含量逐漸增加，休眠現(xiàn)象明顯增加[6]。在成熟過程中ABA的作用是促進種子貯藏蛋白和脂肪的合成，促進種子脫水耐性和種子休眠的獲得，抑制種胚萌發(fā)。GA的主要作用是解除種子休眠，促進萌發(fā)；GA在促進種子萌發(fā)時至少起到兩種信號作用：第一是軟化種胚周圍的組織，克服種皮機械限制，第二是促進種胚的生長[7]。種子休眠或萌發(fā)取決于ABA和GA濃度的平衡，GA含量的高低決定著種子能否萌發(fā)。

GA是解除由ABA誘導(dǎo)的休眠的必要條件。因此對于解除由ABA引起的生理性休眠種子時，用GA處理可有效地促進種子的萌發(fā)。研究表明，用 400 mg·L-1GA3浸泡冬青（Ilex purpurea）種子48 h可顯著提高GA3、細(xì)胞分裂素（CTK）和生長素含量，顯著降低了ABA的含量，從而促進了萌發(fā)[8]；李淑嫻等[9]用500 mg·L-1GA3浸泡烏桕（Sapium sebiferum）種子24 h，可有效打破其種皮內(nèi)含抑制性物質(zhì)的休眠。本研究也發(fā)現(xiàn)，用500 mg·L-1GA3浸泡種子3～5 d，與對照相比，可大大提高種子的萌發(fā)率；對照在試驗期內(nèi)種子未見有萌發(fā)。

GA 通過與ABA 和環(huán)境因子的復(fù)雜作用正向調(diào)節(jié)種子休眠的解除和促進種子萌發(fā)， 由此看來在種子休眠和萌發(fā)方面ABA和GA的作用相互拮抗。但是更多的研究證實ABA /GA，而不是激素的絕對含量控制種子休眠與萌發(fā)[10-11]。對于深休眠種子，不同種源種子內(nèi)的ABA濃度也相差較大，GA處理的效果則不相同。本研究對不同種源的種子進行相同處理后的發(fā)芽率表明差異顯著，其中河南種源的發(fā)芽率僅有12%（資料未列出），最高的是黃山種源達(dá)40%。由此可見不同種源的種子休眠深淺存在明顯差異，因此對GA的響應(yīng)也存在差異。

3.2 層積與休眠

層積處理能解除種子休眠。在水合條件下，大多數(shù)非熱帶物種的種子經(jīng)歷相對低的溫度（通常1～10℃的范圍，一些物種為15℃）能解除休眠。自然條件下， 為了在合適的季節(jié)（通常在春季）萌發(fā)和隨后的生長，水合種子的休眠在冬季通過自然層積被逐漸解除。具物理休眠和生理休眠的種子, 層積處理可有效地解除休眠。對于不同的休眠原因，層積處理解除休眠所需要的時間是不同的：解除蘋果Malus pumila種子的胚休眠需40～50 d的低溫層積，解除胚乳休眠需要70～80 d的低溫層積處理，整個種子則需要80 d以上的低溫處理[12]。通常木本植物的種子需要較長的層積處理時間， 一般為60～90 d，甚至更長；變溫層積可有效解除形態(tài)休眠類種子，凌世瑜[13]研究發(fā)現(xiàn)解除水曲柳Fraxinus mandshurica種子休眠的最佳途徑是先暖溫后低溫的變溫層積處理。本研究也發(fā)現(xiàn)，變溫層積比低溫+變溫層積更有效解除種子的休眠作用，說明變溫層積首先有效促進了胚的后熟作用，同時軟化種皮并降低了種皮中抑制物質(zhì)的含量，從而促進種子萌發(fā)。

3.3 山茱萸種子的休眠與解除

盡管山茱萸種子存在長時間的休眠，但有關(guān)山茱萸種子休眠的研究報道卻相對較少，且其休眠原因仍是一些推測性的結(jié)論，并未作系統(tǒng)的研究。一些研究認(rèn)為山茱萸種子休眠的原因是種皮的抑制性（機械限制和抑制物質(zhì)的存在）、胚未完成生理后熟或未發(fā)育完全[14]。管康林等[15]認(rèn)為高溫對解除種子有一定的效果，研究發(fā)現(xiàn)高溫層積（20～28℃）3個月，再變溫層積（5～17℃）3個月，可使種子發(fā)芽率達(dá)到30～50%；陳惠等[14]認(rèn)為經(jīng)濃硫酸處理16～17 h的種子再用500 mg·L-1GA3浸泡種子24 h后，胚根的露出率可達(dá)40%。

綜合前人研究和本研究結(jié)果，認(rèn)為山茱萸種子的休眠既有種皮原因（物理休眠），也存在種胚后熟問題（形態(tài)休眠）。劉雅帥[5]通過對山茱萸種子的吸水試驗和種皮的掃描電鏡觀察得出其種皮的透水、透氣性差及種皮的機械束縛是種子休眠的原因之一，有力地支持了物理休眠的存在；同時骨質(zhì)種皮內(nèi)的抑制性物質(zhì)（粘性物質(zhì)）是生理休眠的來源之一；本實驗對預(yù)處理前后種子的解剖觀察則提供了胚形態(tài)休眠的證據(jù)，但是否存在胚的形態(tài)生理休眠還需更深入的研究。

基于種子休眠的原因，相應(yīng)的打破種子休眠的方式主要是用GA結(jié)合層積處理。從生產(chǎn)上來說，本研究認(rèn)為目前較為有效的方法是500 mg·L-1GA3浸泡種子24 h以上并結(jié)合變溫層積可有效打破種子的休眠，這和具形態(tài)休眠的銀杏種子的解除方法相似[16]，但該方法并未徹底解除山茱萸種子的休眠；低溫層積較長時間的效果可能會更好，但當(dāng)解除休眠時已錯過了適宜的生產(chǎn)季節(jié)。因此如何在短時間內(nèi)徹底打破種子休眠仍需進一步探討。

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A preliminary study on seed dormancy mechanism and relieving methods in Cornus officinalis

FU Xiang-xiang, ZHOU Xiao-dong, LIU Hong-na
(College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China)

Seed of Cornus officinalis possesses deep dormancy, and begin to geminate after two years stratification. In order to reveal the mechanism of seed dormancy and to overcome seed dormancy of C. officinalis, GA3and stratification treatments were conducted.500 mg·L-1GA3solution was used to soak the seeds for 3 days and 5 days, respectively, before stratification treatments including alternative temperature at 5℃ ～30℃ , cold stratification at 0℃ ～5℃ , as well as cold stratification for 1.5 months followed by alternative temperature. At the same time, the anatomical structures of untreated and treated seeds were observed to compare the changing profiles.The results showed, in some degree, both GA3soaking and stratification treatment could overcome seed dormancy. Seed germination percentages for stratified-treatment for 3 months showed the stratification treatment at alternative temperature played more effective role than cold stratification for 1.5 months followed by alternative temperature on releasing seed dormancy, and it seemed that treatment of cold stratification for short period (≤3 months) had no effect. However, the germination percentage was up to 40% when seeds were treated with cold stratification for 7 months. So, GA3soaking combined stratification is the effective way to release the seed dormancy of C. officinalis. Seed dormancy is supposed to derive from both physical dormancy of seed coat and morphological dormancy of embryo based on comparative observation on anatomical structure of treated and control seeds. In short, the seed dormancy of C. officinalis could be classified into comprehensive dormancy caused by coat and undeveloped embryo.

Cornus officinalis; seed dormancy; GA3; stratification; anatomical structure

S722.1

A

1673-923X(2013)04-0007-06

2012-08-07

國家林業(yè)局948項目“北美四照花類觀賞種質(zhì)資源與培育技術(shù)引進”（項目編號：2012-4-60）

洑香香（1969-），女，教授，博士，研究方向：人工林定向培育、種子生物學(xué)；Email: xxfu@njfu.edu.cn

[本文編校：歐陽欽]