摘要：探討肥胖及肥胖抵抗大鼠NAFLD發(fā)病機(jī)制及運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)不同傾向模型的效果是否存在不同之處，為更好防治NAFLD提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。通過高脂飲食誘導(dǎo)建模，從中遴選出肥胖和肥胖抵抗型兩種大鼠，通過肝組織病理切片確定建模是否成功。而后對(duì)大鼠施加5周的游泳運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，通過測(cè)定體脂、脂體比，血脂、肝指數(shù)、瘦素水平、空腹血糖及胰島素水平等指標(biāo)，觀察運(yùn)動(dòng)對(duì)不同類型NAFLD的干預(yù)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肥胖抵抗組體質(zhì)量與正常組相比差異無顯著性，但肥胖抵抗組與肥胖組同樣存在能量代謝紊亂，肥胖組存在胰島素抵抗和瘦素抵抗，肥胖抵抗組不顯示有胰島素抵抗，存在瘦素抵抗。游泳運(yùn)動(dòng)改善肥胖組NAFLD的效果較肥胖抵抗組更為顯著。結(jié)果表明肥胖組NAFLD與肥胖抵抗組NAFLD發(fā)病機(jī)制并不相同，游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)其干預(yù)效果也不相同。游泳運(yùn)動(dòng)使能耗增加，減少脂質(zhì)沉積，能明顯改善肥胖組的瘦素抵抗，恢復(fù)脂肪-胰島素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)而改善IR，促進(jìn)NAFLD轉(zhuǎn)歸。游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖抵抗組的改善機(jī)制可能不同于肥胖組，主要是通過調(diào)節(jié)瘦素的受體結(jié)合率，改善瘦素抵抗，促進(jìn)NAFLD的轉(zhuǎn)歸。

關(guān) 鍵 詞：運(yùn)動(dòng)生理學(xué)；非酒精性脂肪性肝；肥胖；肥胖抵抗；游泳運(yùn)動(dòng)；大鼠

中圖分類號(hào)：G804.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-7116（2013）01-0129-06

目前，在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中，人們對(duì)于非酒精性脂肪性肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的研究多集中對(duì)肥胖型對(duì)象的防治研究，但越來越多的資料顯示，在非肥胖人群中，NAFLD的發(fā)病機(jī)率也較高。對(duì)NAFLD的防治而言，脂肪分布情況可能比總體脂肪含量更有意義，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)肥胖及肥胖抵抗兩種NAFLD模型進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，旨在探討運(yùn)動(dòng)對(duì)兩種NAFLD模型的糖脂代謝、胰島素抵抗及瘦素抵抗是否存在不同的機(jī)制，為更好防治NAFLD提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料

3月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量（180±19） g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002粵監(jiān)證字2008D007。常規(guī)分籠喂養(yǎng)，自然光照，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±2） ℃，自由飲水進(jìn)食。普通飼料選用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物混合飼料，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高脂飼料采購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。具體成分：按照酪蛋白41.4 g/L、麥芽糖糊精25.6 g/L、纖維素10.0 g/L、胱氨酸0.5 g/L、黃原膠3 g/L、果糖3 g/L和其它物質(zhì)5 g/L加工制備成干粉末。依據(jù)玉米油48.5 g/L、橄欖油28.4 g/L、葵花籽油3 g/L制備混合油。

1.2 動(dòng)物分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)抽取10只，喂食普通飼料，作為正常對(duì)照組（C）；剩余90只喂食高脂高膽固醇飼料，用于制備肥胖與肥胖抵抗型大鼠NAFLD模型。連續(xù)喂養(yǎng)5周后，根據(jù)大鼠體質(zhì)量將模型大鼠分為肥胖組及肥胖抵抗組，并挑出肥胖組體質(zhì)量增加最多的20只，分為肥胖對(duì)照（ON）組10只和肥胖運(yùn)動(dòng)（ONE）組10只；肥胖抵抗組體質(zhì)量增加最少的20只作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分為抵抗肥胖對(duì)照組（OR）10只和抵抗肥胖運(yùn)動(dòng)（ORE）組10只。而后開始進(jìn)行5周的游泳訓(xùn)練，每周運(yùn)動(dòng)6 d，休息1 d，每天運(yùn)動(dòng)1 h。

1.3 取材

運(yùn)動(dòng)周期實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食12 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％水合氯醛麻醉，剖開腹腔后，腹主動(dòng)脈取血，制血清；分離腎周、附睪脂肪墊和肝臟稱量；部分肝組織以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％甲醛固定，制作肝組織病理切片；取部分肝組織，放入液氮保存、待測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1）整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，每周固定時(shí)間測(cè)量大鼠體質(zhì)量、體長(zhǎng)1次。計(jì)算Lee’s指數(shù)。2）采用半自動(dòng)生化分析儀（Eppendorf ECOM-F 6124） Eppendorf Co.Germany檢測(cè)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）以及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量。（3）血清FFA采用比色法，在722分光光度計(jì)上按照試劑盒說明測(cè)試。（4）采用血糖儀測(cè)定血漿葡萄糖；采用雙抗體放射免疫分析法測(cè)定血清胰島素，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=[空腹血糖（FBG）×FINS] /22.5。（5）采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法測(cè)定血清瘦素（leptin）含量（試劑盒由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。（6）肝指數(shù)：稱量肝質(zhì)量與體質(zhì)量，計(jì)算肝型與體重比值，即為肝指數(shù)。（7）通過HE染色制作肝組織病理切片，光鏡下觀察大鼠肝臟脂肪變性情況。（8）肝脂質(zhì)測(cè)定：取適量肝組織，在液氮中研成粉末，稱量后加入氯仿-甲醇（體積比2∶1）抽提脂質(zhì)，離心后取上清測(cè)定其TG、TC。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS for Windows 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（ ±s）來表示，采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有顯著性，P<0.01為差異具有非常顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)的變化

實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束，于取材時(shí)最后一次測(cè)定各組大鼠體質(zhì)量、體長(zhǎng)，計(jì)算Lee’s指數(shù)（見表1），ON組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)明顯高于其他4組（P＜0.01）；運(yùn)動(dòng)干預(yù)組ONE組大鼠體質(zhì)量雖明顯低于ON組（P＜0.01），但仍高于C組（P＜0.05）；ORE組大鼠體質(zhì)量低于ONE組（P＜0.05）；OR組大鼠與C組相比體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)均有增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；OR組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)均明顯低于ON組（P＜0.01）（見表1）。

2.2 對(duì)大鼠體脂及脂體比的影響

如表2，ON組大鼠腎周脂肪墊、附睪周脂肪墊顯著高于其他各組（P＜0.01）；ONE組與ON組相比，腎周附睪脂肪均明顯減少（P＜0.05），其他各組間變化不明顯。

2.3 血脂、ALT及肝內(nèi)脂質(zhì)含量

實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后，ON組血清TC顯著高于其他各組（P<0.01）；ON組LDL-C、FFA及肝指數(shù)、肝組織TG含量均顯著高于C組（均P<0.01），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）高于C組（P＜0.05）； OR組LDL-C、FFA顯著高于C組（P＜0.01），肝TG、ALT水平高于C組（P＜0.05）；ONE組FFA、肝指數(shù)、ATL顯著低于ON組（P＜0.05），肝TG非常顯著低于ON組（P＜0.01）；ORE組FFA顯著低于C組（P＜0.05）；ORE組肝指數(shù)，肝TG與ON組相比，非常顯著性降低（P＜0.01），LDL-C、ALT水平顯著降低（P＜0.05），與C組相比FFA升高呈顯著差異（P＜0.05）；OR組肝指數(shù)、肝TG與ON組相比有所下降，呈顯著差異（P＜0.05）（表3）。

2.4 肝組織病理學(xué)改變

肉眼觀察，正常對(duì)照組大鼠肝臟多呈暗紅色，邊緣銳利，光鏡下如圖1a，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝條索排列整齊；ON組和OR組肉眼觀察體積增大，邊緣圓鈍，顏色發(fā)黃，切面有油膩感，光鏡下分別見圖1b和圖1d：ON組，多見肝細(xì)胞腫脹、氣球樣變，胞質(zhì)內(nèi)脂滴沉積，肝條索不清晰；OR組，多見肝細(xì)胞腫脹，肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，多見中等量肝細(xì)胞脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。ONE組肝組織顏色肉眼觀察接近于正常對(duì)照組，光鏡下見圖1c肝小葉結(jié)構(gòu)尚清晰，少量肝細(xì)胞脂肪變性，無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；ORE組光鏡下見圖1e，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，條索可見，視野下可見少量脂肪空泡（見圖1）。

2.5 大鼠血糖、FINS、HOMA-IR、血清TG和LP的比較

ON組血糖、FINS、HOMA-IR、血清TG和LP水平顯著高于C組（P＜0.01）；FINS和血清TG顯著高于OR組（P＜0.01）；LP水平高于OR組（P＜0.05）。ONE組TG、LP水平顯著低于ON組（P＜0.01）；FINS和HOMA-IR低于ON組（P＜0.05）。OR組FINS、TG和LP水平高于C組（P＜0.05）；HOMA-IR顯著高于C組（P＜0.01）。ORE組TG水平高于C組（P＜0.05）；HOMA-IR低于OR組（P＜0.05）（表4）。

2.6 血清TG、LP、FBG、FINS和HOMA-IR之間的相關(guān)性

血清TG與LP呈正相關(guān)（r＝0.685，P＜0.01）；瘦素與血糖呈正相關(guān)（r＝0.632，P＜0.01）；HOMA-IR與FBG、FINS、LP呈正相關(guān)（r＝0.712、r＝0.815、r＝0.584、P＜0.01）。

3 討論

3.1 飲食誘導(dǎo)肥胖與肥胖抵抗型NAFLD大鼠

NAFLD的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，較多學(xué)者普遍接受的是Day在1998年提出的“二次打擊”學(xué)說[1]。第1次打擊主要是脂質(zhì)代謝紊亂使外周脂肪分解速率增強(qiáng)和血清游離脂肪酸增加，進(jìn)而使肝臟合成分解的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，F(xiàn)FA不斷的被運(yùn)送到肝臟，而肝臟的氧化利用能力降低及分泌VLDL下降加重TG血癥，使脂肪在肝內(nèi)蓄積，進(jìn)而參與脂肪肝的形成；第2次打擊是升高的FFA可以在胰島素受體水平或受體后水平引起胰島素抵抗，進(jìn)一步加劇肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪異位沉積，伴隨不斷增強(qiáng)的氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致NAFLD。

王重建等[2]的研究顯示，飲食誘導(dǎo)肥胖易感性差異在人群調(diào)查與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中普遍存在。在NAFLD的致病因素中，超重和肥胖已經(jīng)得到普遍認(rèn)可，但是在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)并不是所有的NAFLD對(duì)象都存在肥胖或超重，同時(shí)也存在體質(zhì)量略增或變化不大的現(xiàn)象。在高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型實(shí)驗(yàn)中，存在肥胖和肥胖抵抗兩種趨勢(shì)。在研究中發(fā)現(xiàn)，盡管肥胖抵抗組與肥胖組在體質(zhì)量上存在顯著差異，與正常對(duì)照組相比無明顯差別；ON組與OR組大鼠FFA、LDL-C、肝TG、FINS、血清TG和LP水平較正常對(duì)照組均有升高，但升高幅度不同，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組HDL水平無明顯變化。提示肥胖抵抗NAFLD模型組存在與肥胖NAFLD組同樣的能量代謝紊亂。

3.2 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖及肥胖抵抗型NAFLD大鼠的影響及可能的作用機(jī)制

目前，臨床上對(duì)于NAFLD的治療多采用藥物，但是缺乏行之有效的藥物，且基于醫(yī)學(xué)上防治重于治療的思想，在日常生活中改變生活方式和飲食習(xí)慣，積極參加體育活動(dòng)進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)也成了防治NAFLD的重要手段。

胰島素抵抗表現(xiàn)為胰島素的敏感性降低，胰島素抵抗指數(shù)是反映胰島素抵抗的較好的指標(biāo)。Capeau[3]認(rèn)為胰島素抵抗引發(fā)的胰島素高脂血癥在脂肪肝的發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用；王瑩等[4]在研究中發(fā)現(xiàn)，肥胖型NAFLD大鼠血糖顯著高于正常對(duì)照組，肥胖抵抗型大鼠血糖有增高趨勢(shì)，且兩組大鼠均存在胰島素抵抗現(xiàn)象，認(rèn)為與NAFLD的發(fā)病關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ON組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR水平顯著高于正常對(duì)照組，OR組FBG變化不明顯，但FINS和HOMA-IR水平卻高于正常對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。McLaughlin等[5]認(rèn)為可以將c（TG）≥1.5 mmol/L及TC之比HDL-C≥3作為胰島素抵抗的指標(biāo)。根據(jù)McLaughlin的判定標(biāo)準(zhǔn)，在本實(shí)驗(yàn)中ON組出現(xiàn)胰島素抵抗，但OR組并不符合上述判定胰島素抵抗的標(biāo)準(zhǔn)。提示，在肥胖致NAFLD過程中，胰島素抵抗在NAFLD進(jìn)程中起重要作用；在肥胖抵抗模型中，并不存在胰島素抵抗，提示，在肥胖抵抗致NAFLD過程中，其導(dǎo)致NAFLD的機(jī)制與肥胖致NAFLD并不相同。

近年來，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝與血清瘦素水平有密切關(guān)系，血清瘦素是脂肪肝發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；也有研究表明，血清瘦素升高與肝硬化關(guān)系密切，如Tobe等[6]研究發(fā)現(xiàn)脂肪肝患者血漿瘦素水平明顯高于對(duì)照組，多元回歸分析表明瘦素是脂肪肝發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。楊建鋒等[7]在一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝NAFLD患者的血清瘦素水平顯著高于正常對(duì)照組，并且其增高水平隨著脂肪肝的嚴(yán)重程度增加而逐漸升高。

現(xiàn)有的研究表明，大部分的NAFLD患者并非由于血清瘦素缺乏所致。相反的是體內(nèi)瘦素的水平相對(duì)正常人群來說較高，提示可能存在一定程度的瘦素抵抗。在眾多實(shí)驗(yàn)研究中，肥胖個(gè)體大多伴有瘦素抵抗已經(jīng)得到廣泛共識(shí)，Pal R等[8]向膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠進(jìn)行中樞注射瘦素，并不能減輕肥胖，可能存在瘦素受體及受體后障礙。在本實(shí)驗(yàn)中，OR組大鼠出現(xiàn)了明顯的LP水平非常顯著高于對(duì)照組，ON組大鼠LP水平也高于對(duì)照組，但程度不同。說明兩組模型均出現(xiàn)了不同程度的瘦素抵抗。瘦素抵抗的機(jī)制目前尚不十分明確，有研究認(rèn)為是瘦素通過血腦屏障的過程發(fā)生了障礙，Levin等[9]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高脂誘導(dǎo)前，瘦素通過肥胖與肥胖抵抗大鼠血腦屏障的量并無差別；但在高脂誘導(dǎo)后，瘦素通過肥胖大鼠血腦屏障的量低于肥胖抵抗組大鼠。并在研究中發(fā)現(xiàn)，肥胖傾向大鼠在誘導(dǎo)前，其下丘腦瘦素受體mRNA的表達(dá)及瘦素的中樞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力就比肥胖抵抗大鼠低。提示，瘦素抵抗在一定程度上受先天遺傳的作用。但是瘦素抵抗并不僅是先天遺傳所決定的，高脂高膽固醇飲食也可以導(dǎo)致瘦素抵抗，在本實(shí)驗(yàn)中OR組大鼠也出現(xiàn)了不同程度的瘦素抵抗。

一般情況下，高脂高膽固醇飲食會(huì)引起實(shí)驗(yàn)對(duì)象內(nèi)源性瘦素水平升高，從而增強(qiáng)機(jī)體的脂質(zhì)代謝能力，可是由于肥胖大鼠本身存在的瘦素抵抗傾向或在肥胖大鼠中存在瘦素的中樞運(yùn)轉(zhuǎn)的血腦屏障障礙，使瘦素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷，不能發(fā)揮應(yīng)有的調(diào)節(jié)作用，出現(xiàn)瘦素抵抗，進(jìn)而破壞脂肪-胰島素軸的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，加重胰島素抵抗。肥胖個(gè)體瘦素受體敏感性降低，從而引起脂肪-胰島素負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制受到破壞，從而引起高胰島素血癥，胰島素抵抗，進(jìn)一步促進(jìn)肝脂肪酸合成，引起非酒精性脂肪肝。

NAFLD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ON組大鼠出現(xiàn)了胰島素抵抗，而OR組大鼠并沒有出現(xiàn)胰島素抵抗；ON組和OR組大鼠均出現(xiàn)了不同程度的瘦素抵抗，提示兩種模型致NAFLD的發(fā)病機(jī)制并不完全相同，OR組大鼠可能先是由瘦素抵抗的獨(dú)立因素導(dǎo)致NAFLD，但在延長(zhǎng)OR組高脂高膽固醇飲食周期時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)個(gè)別大鼠也出現(xiàn)了胰島素抵抗。楊建鋒等[7]通過對(duì)homa-zr（采用穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法的胰島素抵抗指數(shù)）的多元逐步回歸分析認(rèn)為，瘦素是影響胰島素抵抗的最主要因素之一，推測(cè)提示肥胖個(gè)體是由于瘦素抵抗使血清瘦素濃度明顯升高，從而產(chǎn)生或加重胰島素抵抗，導(dǎo)致非酒精性脂肪肝的發(fā)生。一般情況下，瘦素可以抑制胰島素的分泌，包括胰島素原mRNA的表達(dá)和胰島素的釋放，當(dāng)瘦素水平升高，但受體及受體后水平障礙即出現(xiàn)瘦素抵抗時(shí)，瘦素對(duì)胰島素分泌的抑制作用減弱，導(dǎo)致高胰島素血癥，繼而降低胰島素受體數(shù)量，從而引起胰島素抵抗，這可能在OR組延長(zhǎng)高脂高膽固醇飲食引起胰島素抵抗的原因。

游泳運(yùn)動(dòng)改善肥胖型NAFLD的原因可能有以下幾個(gè)方面：（1）游泳運(yùn)動(dòng)使機(jī)體的能耗增加，提高了FFA的氧化供能，從而使得肝臟的脂質(zhì)沉積減少，恢復(fù)肝臟的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)；（2）長(zhǎng)期有規(guī)律的游泳運(yùn)動(dòng)可以增加瘦素受體的敏感性，增加瘦素與瘦素受體的結(jié)合率，修復(fù)瘦素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，恢復(fù)脂肪-胰島素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)而改善胰島素抵抗，促進(jìn)NAFLD的轉(zhuǎn)歸。（3）長(zhǎng)期游泳運(yùn)動(dòng)可以大量利用肝糖元，減少肝臟內(nèi)FFA的再合成，有利于NAFLD的良性轉(zhuǎn)歸。

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