摘要:以天門(mén)冬(Asparagus cochinchinensis)幼嫩莖段為外植體,考察1 g/L HgCl2滅菌時(shí)間對(duì)外植體的消毒效果,以及激素濃度組合對(duì)外植體愈傷組織、不定芽的誘導(dǎo)和不定芽生根的影響。結(jié)果表明,1 g/L HgCl2處理7 min,外植體褐化率和污染率較低;MS+0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養(yǎng)基中的愈傷組織誘導(dǎo)率最高,且生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng),MS+1.0 mg/L 6—BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養(yǎng)基中的出芽率最高;1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA培養(yǎng)基中生根率最高,可達(dá)76%。
關(guān)鍵詞:天門(mén)冬(Asparagus cochinchinensis);莖段;組織培養(yǎng)
中圖分類(lèi)號(hào):S567.23+9;S339.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439—8114(2012)19—4396—03
天門(mén)冬(Asparagus cochinchinensis(Lour.)Merr.)為百合科天門(mén)冬屬的一種[1],其藥用塊根性寒,味甘、苦,歸肺、腎、胃經(jīng),具有養(yǎng)陰潤(rùn)燥、清肺生津等功能,是珍貴的藥用植物。同時(shí),作為一種重要的切葉植物和園林綠化植物,天門(mén)冬有廣泛的種植前景。近年來(lái),隨著天門(mén)冬藥材的需求量不斷增大,亂挖濫采導(dǎo)致其野生資源日益枯竭,而天門(mén)冬的人工栽培雖然取得了一定的成果,但還未廣泛推廣[2,3]。目前,天門(mén)冬的栽培繁殖主要依靠分株繁殖和種子繁殖,分株繁殖增殖系數(shù)較低,成活率受諸多因素影響;種子繁殖發(fā)芽率低,并且發(fā)芽的整齊度不高,出苗所需時(shí)間長(zhǎng),種植時(shí)難以控制栽植時(shí)間,管理費(fèi)時(shí)費(fèi)工[4]。因此,開(kāi)展天門(mén)冬組織培養(yǎng)技術(shù)研究,可解決種苗缺乏問(wèn)題,有利于快速繁殖大量?jī)?yōu)質(zhì)的無(wú)毒種苗,為天門(mén)冬的人工栽培、工廠(chǎng)化和規(guī)?;a(chǎn)等奠定基礎(chǔ),具有重要的實(shí)際意義。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
采集廣西藥用植物園種質(zhì)資源圃中天門(mén)冬植株的幼嫩莖段作為天門(mén)冬組織培養(yǎng)的外植體。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 HgCl2處理時(shí)間對(duì)外植體污染率和褐化的影響 取天門(mén)冬的幼嫩枝條,用自來(lái)水沖洗去掉殘留在枝條上的碎泥等,剪成1.0~2.0 cm長(zhǎng)的小莖段,放在加有1%洗潔精的洗滌液中浸泡5~8 min,在自來(lái)水下用細(xì)流水沖洗20 min。在超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇消毒10~40 s,無(wú)菌水沖洗3~5次,1 g/L HgCl2分別處理5、7、10 min,再用無(wú)菌水沖洗5次,用棉布吸干部分水分后,切去末端部分組織,供接種用。
將經(jīng)滅菌處理后未變色、無(wú)褐化的莖段接入MS+1.5 mg/L 6—BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L KT培養(yǎng)基中進(jìn)行初代培養(yǎng),接種3周后統(tǒng)計(jì)各處理外植體的污染率及褐化情況。
1.2.2 激素組合及濃度對(duì)天門(mén)冬愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的影響 當(dāng)初代培養(yǎng)的不定芽長(zhǎng)至0.5~1.0 cm高時(shí),將其轉(zhuǎn)入添加了不同濃度6—BA(0、0.5、1.0 mg/L)、KT(0、0.2、1.0 mg/L)和NAA(0、0.2、1.0 mg/L)的MS培養(yǎng)基中,20 d后統(tǒng)計(jì)各處理愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)情況。將獲得的不定芽在MS+1.0 mg/L 6—BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L KT增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。
1.2.3 激素濃度對(duì)天門(mén)冬不定芽生根誘導(dǎo)的效果 以1/2MS為生根培養(yǎng)基,分別附加不同濃度的NAA(0、0.5、1.0 mg/L)和IBA(0、0.5、1.0 mg/L),進(jìn)行生根培養(yǎng)。
2 結(jié)果與分析
2.1 HgCl2處理時(shí)間對(duì)外植體污染率和褐化率的影響
天門(mén)冬外植體的污染率隨著1 g/L HgCl2處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低(表1),但褐變率呈上升趨勢(shì)。滅菌5 min時(shí),外植體污染率高達(dá)87.5%;只有幾個(gè)極幼嫩的莖尖未出現(xiàn)污染;滅菌10 min時(shí),滅菌效果最好,污染率大大降低,但同時(shí)褐變外植體個(gè)數(shù)也增多;滅菌7 min時(shí),雖然污染率仍達(dá)17.5%,但誘導(dǎo)效果較好,腋芽萌發(fā)整齊。因此,天門(mén)冬外植體的HgCl2滅菌時(shí)間宜為7 min。
2.2 激素濃度組合對(duì)天門(mén)冬莖段愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的影響
除對(duì)照外,添加不同濃度激素的MS培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)天門(mén)冬莖段產(chǎn)生愈傷組織(表2),愈傷組織誘導(dǎo)率為4%~36%,其中MS+0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養(yǎng)基中的愈傷組織誘導(dǎo)率最高,且生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)。而從不定芽的誘導(dǎo)來(lái)看,MS+1.0 mg/L 6—BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養(yǎng)基中的出芽率最高,達(dá)到了92%(圖1)。
2.3 激素濃度組合對(duì)天門(mén)冬不定芽生根的影響
天門(mén)冬不定芽在增殖培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6—BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L KT)中培養(yǎng)20 d左右,即可獲得4~5倍的增殖系數(shù)(圖2)。將高約2~3 cm的天門(mén)冬不定芽剪下接種到含不同濃度IBA和NAA的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng),25 d左右后,不定芽基部皮層形成4~6條粗細(xì)不一、長(zhǎng)1~3 cm的不定根。從表3可以看出,不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)天門(mén)冬芽苗生根,單獨(dú)添加IBA或NAA時(shí),生根率均較低,為25%~49%。當(dāng)0.5 mg/L IBA和0.5 mg/L NAA配合使用時(shí),對(duì)生根有明顯的促進(jìn)作用,生根率達(dá)到76%,且生根速度也加快(圖3)。
2.4 煉苗和移栽
煉苗方式、移栽基質(zhì)和光照度對(duì)試管苗移栽成活率都有很大的影響。苗高約5 cm時(shí)開(kāi)始煉苗,移栽前先把試管苗移出培養(yǎng)室,閉瓶煉苗6 d,再將培養(yǎng)瓶蓋打開(kāi),在全天自然光照、溫度25 ℃的通風(fēng)條件下煉苗3~5 d,移栽時(shí)用鑷子或玻璃棒將生根苗從培養(yǎng)瓶中取出,用清水洗干凈根部殘留培養(yǎng)基,移栽入已滅過(guò)菌的基質(zhì)中(菜園土與河沙等體積混勻),移栽后7~10 d內(nèi)用塑料薄膜保濕,光照強(qiáng)度以遮光率為60%左右最為適宜,保持空氣濕度在85%以上,每天噴霧1次,14 d左右長(zhǎng)出新根,每株平均根數(shù)為2~5條,30 d后試管苗移栽成活率達(dá)82%以上。
3 小結(jié)與討論
天門(mén)冬作為中成藥、化妝品、飲料及食品等的重要原料被廣泛應(yīng)用[5—7],采用組培快繁技術(shù)可在短期內(nèi)獲得大量種苗。而在組培快繁過(guò)程中,HgCl2處理時(shí)間是影響植株莖段初期誘導(dǎo)的最重要因素之一,從理論上來(lái)說(shuō),HgCl2處理時(shí)間越長(zhǎng),滅菌越徹底,滅菌效果越好,但是滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)破壞外植體的組織結(jié)構(gòu)從而引起褐變,降低外植體的成活率。為了盡量減少外植體褐化并獲得較佳滅菌效果,1 g/L HgCl2處理時(shí)間宜為7 min。不添加激素的MS培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)愈傷組織的形成,單獨(dú)添加6—BA、KT或NAA,愈傷組織誘導(dǎo)率及出芽率均較低,最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT;最佳的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6—BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。天門(mén)冬不定芽的生根以IBA和NAA混合使用效果最好,最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA。
試管苗的移栽成活在組培苗的生產(chǎn)中也非常關(guān)鍵,其在培養(yǎng)室內(nèi)有人工提供的適宜溫度、豐富的養(yǎng)分與充足的水分,因此移栽到自然環(huán)境中前需要進(jìn)行煉苗,以提高存活率。根長(zhǎng)為1 cm左右時(shí)移栽最佳,根過(guò)長(zhǎng)容易折斷,影響成活率。
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