摘要：采用超聲醇提法從平臥菊三七（Gynura procumbens）中提取綠原酸，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、pH、超聲功率對(duì)綠原酸提取率的影響。通過(guò)靜態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)優(yōu)選適合綠原酸純化的大孔樹(shù)脂，并運(yùn)用單因素試驗(yàn)優(yōu)化動(dòng)態(tài)吸附—解吸條件。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶15（m∶V，g/mL）、pH 4、超聲功率120 W，此條件下綠原酸得率為3.13%。HPD600型樹(shù)脂對(duì)綠原酸有較高的吸附率和解吸率，優(yōu)化后的吸附條件為上樣流速2 mL/min、pH 3；適宜的洗脫劑為體積分?jǐn)?shù)30%和50%的乙醇，純化后綠原酸的純度為77.4%。

關(guān)鍵詞：平臥菊三七（Gynura procumbens）；綠原酸；提取；純化

中圖分類號(hào)：R284.2；S567.23+6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439—8114（2012）19—4348—04

平臥菊三七（Gynura procumbens （Lour） Merr.）為菊科三七屬多年生草本藥食兩用植物[1]，近代藥理研究表明其具有降壓[2，3]、降糖[4，5]、降脂[5]、抗氧化[6]、消炎[7]、抗癌[8，9]等功效。其主要活性成分有綠原酸、黃酮類、生物堿、萜烯類、香豆素類等[10—13]。綠原酸是植物在有氧呼吸過(guò)程中由磷酸戊糖途徑（HMS）的中間產(chǎn)物合成的一種苯丙素類物質(zhì)，它包括綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、萊薊素等十多種同分異構(gòu)體，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、降糖、清除自由基等作用，是保健品、食品、藥品及化妝品的重要原料。綠原酸在植物界廣泛存在，在忍冬科和菊科植物中含量較高[14—17]。本研究采用超聲波醇提法從平臥菊三七中提取綠原酸，并選用吸附容量大、選擇性好、吸附迅速、解吸容易、再生簡(jiǎn)單的大孔樹(shù)脂對(duì)其進(jìn)行純化，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用平臥菊三七提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平臥菊三七葉采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥園，烘干粉碎后過(guò)60目篩，裝袋備用；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品由湖南瀏陽(yáng)艾特天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)；無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純；大孔樹(shù)脂AB—8、S—8、NKA—2、NKA—9、X—5、HPD600、D101、H103均購(gòu)于滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

UV—754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；LXJ—ⅡB低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ3200DB型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；pH計(jì)（Thermo電子公司）；恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；小型粉碎機(jī)（長(zhǎng)沙市常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠）；ZHWY—1102型搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲波輔助乙醇浸提法提取綠原酸 ①提取工藝流程。稱取1 g左右平臥菊三七葉樣品粉末→加入適量石油醚揮干備用→超聲波輔助乙醇提取→離心→取上層清液→定容至25 mL→吸取1 mL溶液定容到25 mL容量瓶，得平臥菊三七提取液[18]。②綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[19]。稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的甲醇溶液定容于25 mL的容量瓶，配制成200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用移液管分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于25 mL容量瓶中，用70%的甲醇溶液定容，配成濃度分別為8、16、24、32、40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)328 nm下測(cè)定吸光度，得到綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X//μg/mL）與吸光度A328 nm（Y）的回歸方程為Y=0.041 3X—0.015 7，R2=0.999 6（圖1）。③正交試驗(yàn)優(yōu)化綠原酸提取工藝。設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)考察pH、料液比、超聲波超聲功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)平臥菊三七中綠原酸提取率的影響，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.2.2 大孔樹(shù)脂純化綠原酸

1）工藝流程。平臥菊三七提取液→依次經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取得水相液作為樣液→上樣于大孔樹(shù)脂→不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行梯度洗脫→接綠原酸含量最高的洗脫液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮洗脫液除去乙醇→冷凍干燥得綠原酸粗品。

2）樹(shù)脂的預(yù)處理[20]。各種樹(shù)脂分別用雙蒸水溶脹、浮選后，在1 mol/L NaOH溶液中浸泡4 h，用雙蒸水洗至中性；然后用0.5 mol/L HCl溶液浸泡24 h，不斷攪拌，用雙蒸水洗至中性；再在70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙醇溶液中浸泡24 h并不斷攪拌，用去離子水洗至無(wú)白色渾濁、無(wú)乙醇味后用雙蒸水浸泡待用。

3）樹(shù)脂的靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)。①靜態(tài)吸附。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的樹(shù)脂1 g，裝入150 mL磨口三角瓶中，加入50 mL已測(cè)定濃度的樣液，蓋緊瓶塞，在25 ℃恒溫水浴搖床上振搖24 h，充分吸附后過(guò)濾，測(cè)定吸附液中綠原酸的濃度，按式（1）和式（2）計(jì)算吸附量Q和吸附率E。②靜態(tài)解吸。將完成吸附的樹(shù)脂過(guò)濾后放入150 mL磨口燒瓶中，加入50 mL 70%的乙醇，在25 ℃恒溫水浴搖床上振搖24 h，收集洗脫液，測(cè)定吸光度，按式（3）計(jì)算解吸率D。

Q=■ （1）

E=■×100% （2）

D=■×100% （3）

式中，Q為吸附量（mg/g）；C0為綠原酸樣品的初始濃度（mg/mL）；Ce為吸附后樣液中綠原酸的濃度（mg/mL）；V為吸附液體積（mL）；W為樹(shù)脂質(zhì)量（g）；C2為解吸液的濃度（mg/mL）；V2為解吸液體積（mL）。

4）樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附與洗脫試驗(yàn)。①上樣流速對(duì)泄漏率的影響[21]。把處理好的樹(shù)脂裝入吸附柱，上樣液流速分別為2、4、6、8、10 mL/min，分別收集不同流速下的流出液，按式（4）計(jì)算泄漏率。②上樣液pH對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響[21]。分別調(diào)節(jié)上柱液的pH為2、3、4、5、6，以一定的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，檢測(cè)其中綠原酸的含量，計(jì)算其吸附率。③梯度洗脫曲線的繪制。取50 mL的樹(shù)脂裝柱，調(diào)節(jié)提取液pH為3，按流速2 mL/min上樣進(jìn)行吸附。待吸附完全后，依次用去離子水和體積分?jǐn)?shù)分別為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇水溶液各5 BV進(jìn)行洗脫，分別收集每BV洗脫液，測(cè)定吸光度，繪制梯度洗脫曲線。

泄漏率=■×100% （4）

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

平臥菊三七中綠原酸提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，利用DPS軟件進(jìn)行極差分析、方差分析和Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，優(yōu)選出超聲波輔助醇提法提取平臥菊三七中綠原酸的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明，各因素對(duì)綠原酸提取率的影響由大到小依次為料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH、超聲功率。其中料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH對(duì)綠原酸提取的影響極顯著，超聲功率的影響不顯著。最佳提取工藝為A3B1C2D2，即pH 4、料液比1∶15（m∶V，g/mL）、超聲功率120 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到綠原酸的平均提取率為3.13%，高于正交試驗(yàn)組合的最高值，說(shuō)明該結(jié)果是可靠的。

2.2 樹(shù)脂的靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)結(jié)果

表3為8種樹(shù)脂對(duì)綠原酸的吸附和解吸效果。從表中可以看出，S—8、H103、HPD600的吸附率高于其他5種樹(shù)脂，而HPD600的解吸率遠(yuǎn)高于其他類型的樹(shù)脂，考慮到綠原酸的極性與大孔樹(shù)脂的吸附解吸特性，HPD600樹(shù)脂為適合用于綠原酸純化的樹(shù)脂。

2.3 HPD600樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附與洗脫試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 上樣流速對(duì)泄漏率的影響 上樣流速影響吸附質(zhì)向樹(shù)脂表面的擴(kuò)散，從而決定吸附效果。如果流速太快，吸附質(zhì)分子來(lái)不及擴(kuò)散到樹(shù)脂內(nèi)表面就已經(jīng)從柱中流出而泄漏，造成樣品流失，但流速太慢會(huì)造成試驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)，增加成本。圖2為不同流速下樣品的泄漏率。從圖中可以看出，綠原酸泄漏率隨上樣流速的加快而升高，上樣流速大于4 mL/min時(shí)，綠原酸的泄漏率迅速升高。

2.3.2 上樣液pH對(duì)綠原酸吸附率的影響 圖3為上樣液pH對(duì)動(dòng)態(tài)吸附綠原酸吸附率的影響?？梢钥闯觯G原酸的吸附率隨pH的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，pH為3時(shí)吸附率最高。這可能是由于綠原酸作為多羥基酚酸在酸性條件下以分子形式存在，疏水性增強(qiáng)，易被樹(shù)脂吸附；但在強(qiáng)酸性條件下以內(nèi)酯形式存在的綠原酸易水解。

2.3.3 梯度洗脫曲線的繪制 分別選用體積分?jǐn)?shù)10%、30%、50%、70%、90%的乙醇作為洗脫劑，綠原酸的洗脫效果有較大差異（圖4）。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，洗脫液中綠原酸濃度很低，將此部分洗脫液冷凍干燥，干粉呈淡灰色，在空氣中易吸潮，與蒽酮試劑反應(yīng)呈綠色，與費(fèi)林試劑反應(yīng)有紅色沉淀產(chǎn)生。這些特點(diǎn)與糖的特性相吻合，因此可以采用10%的乙醇把提取物中糖類化合物分離出來(lái)。乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%和50%時(shí)均出現(xiàn)了洗脫液濃度峰，這可能是因?yàn)樽贤夥止夤舛扔?jì)測(cè)得的數(shù)據(jù)為總綠原酸含量，不同濃度洗脫劑的洗脫液中含有不同種類的綠原酸，綠原酸的單體分離工作還有待下一步試驗(yàn)研究。將此部分洗脫液收集起來(lái)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇再冷凍干燥后得到綠原酸粗品，紫外分光光度法測(cè)得綠原酸純度為77.4%。

3 結(jié)論

運(yùn)用正交試驗(yàn)得到超聲輔助醇提法從平臥菊三七中提取綠原酸的工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶15（m∶V，g/mL）、pH 4、超聲功率120 W，綠原酸提取率為3.13%。通過(guò)靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)得到純化綠原酸的最佳樹(shù)脂為HPD600型，通過(guò)動(dòng)態(tài)解吸試驗(yàn)得到最佳樹(shù)脂的吸附—解吸條件為上樣流速2 mL/min、pH 3，分別用5 BV的去離子水和體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇洗脫后依次用5 BV的體積分?jǐn)?shù)30%及50%的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去乙醇后冷凍干燥，得到的綠原酸純度為77.4%。

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