摘要：采用乙醇回流法從葛根（Radix Puerariae）渣中提取葛根多糖，在單因素試驗的基礎(chǔ)上設計正交試驗優(yōu)化多糖提取工藝，并測定提取的葛根多糖的抗氧化活性。結(jié)果表明，優(yōu)化的乙醇回流法提取葛根多糖的工藝條件為回流時間2.0 h、乙醇體積分數(shù)75%、料液比1∶40（m∶V，g/mL）、回流溫度95 ℃，葛根多糖提取率為1.209%。提取的葛根多糖對O2—·和H2O2均有一定的清除作用，濃度為200 mg/L時，其對O2—·和H2O2的清除率分別為18.52%和13.68%。

關(guān)鍵詞：葛根（Radix Puerariae）渣；多糖；乙醇回流法；抗氧化活性

中圖分類號：O629.12 文獻標識碼：A 文章編號：0439—8114（2012）19—4344—04

葛根（Radix Puerariae）是多年生藤本植物野葛（Pueraria lobata）的根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉等功效[1]。中國葛根資源極為豐富，除新疆、西藏、青海外，各省均有分布[2]。目前對葛根的研究和利用尚處于起步階段，主要是從葛根中提取淀粉和黃酮類化合物，提取之后剩下大量的葛根渣。葛根渣含有大量粗纖維及多糖等營養(yǎng)成分，但是喂豬不消化，作肥不腐爛，隨意傾倒又造成環(huán)境污染和資源浪費，加強葛根渣的綜合利用是葛根加工業(yè)中一個亟需解決的重要問題。

大量藥理及臨床研究證實，多糖具有多種生物學功能，如降血糖作用[3]、提高機體的免疫功能[4]、抗輻射[5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、抗衰老[8]、抗氧化活性[9]、保鮮[10]、抗突變[11]等。本研究以乙醇溶液為提取溶劑，通過加熱回流方式從葛根渣中提取多糖，優(yōu)化提取工藝并測定其抗氧化活性，旨在為葛根多糖的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗儀器：UV—2102.PC型紫外可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司），SSW型微電腦電熱恒溫水槽（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），電子天平（梅特勒—托利多儀器上海有限公司），微量移液器（上海榮泰生化工程有限公司），SHZ—III型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）。

試驗試劑濃硫酸、苯酚、葡萄糖、鄰苯三酚、Tris等均為國產(chǎn)分析純。

試驗材料野生葛根渣取自上饒縣農(nóng)戶，為葛根提取葛粉之后曬干的殘渣。

1.2 試驗方法

1.2.1 苯酚—硫酸法制作葡萄糖標準曲線[12] 分別取0.506 mg/mL葡萄糖標準液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于試管中，加水補至2.0 mL，另一試管加入2.0 mL蒸餾水作為空白對照。各試管分別加入60 mg/mL的苯酚1.0 mL，然后迅速加入98%的濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置5 min，置沸水浴中水浴15 min。取出冷卻至室溫后于490 nm處測定其吸光度。以葡萄糖溶液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。葡萄糖在0～0.253 0 mg/mL范圍內(nèi)濃度（X//mg/mL）與吸光度（A490 nm）呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=5.814 2X+0.114 3，r=0.990 8。

1.2.2 單因素試驗 準確稱取干燥的葛根渣5 g，加入一定體積的乙醇溶液，在一定溫度下加熱回流一定時間后過濾，收集濾液，定容至100 mL，制得樣液，參照“1.2.1”的方法測其吸光度，根據(jù)回歸方程計算樣品溶液中多糖的濃度，并計算葛根多糖提取率。設置單因素試驗考察回流時間、加熱溫度、乙醇溶液體積分數(shù)和料液比對多糖提取率的影響。①回流時間。在回流溫度80 ℃、料液比1∶20（m∶V，g/mL，下同）、乙醇體積分數(shù)80%的條件下分別回流0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。②乙醇體積分數(shù)。分別采用體積分數(shù)75%、80%、85%、90%的乙醇作為提取劑，在回流溫度80 ℃、料液比1∶20的條件下回流1 h。③料液比?；亓鳒囟?0 ℃、分別按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的料液比加入體積分數(shù)80%的乙醇，回流1 h。④回流溫度。按1∶40的料液比加入體積分數(shù)80%的乙醇，分別在80、85、90、95 ℃回流1 h。

1.2.3 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上設計四因素三水平正交試驗，進一步優(yōu)化提取工藝，因素與水平見表1。

1.2.4 葛根多糖還原能力的測定[13]

1）對超氧陰離子自由基（O2—·）的清除作用。將按最佳工藝條件提取得到的多糖溶液配制成20、40、80、200 mg/L的溶液。取50 mmol/L pH 8.2的Tris—HCl緩沖溶液（含1 mmol/L EDTA）7.0 mL，加入1.0 mL去離子水，混勻后25 ℃水浴20 min，取出后立即加入1.0 mL 25 ℃預熱的3 mmol/L鄰苯三酚，混勻后立即倒入比色池，以蒸餾水為空白對照，于325 nm處每隔30 s測定一次吸光度，共測定5 min，其吸光度隨時間的變化率記作A；在加入鄰苯三酚前先加入1.0 mL不同濃度的多糖溶液，其吸光度隨時間的變化記作B。

多糖對O2—·的清除率E1=（1—A/B）×100% （1）

2）對過氧化氫（H2O2）的清除作用。4份1 mL濃度分別為20、40、80、200 mg/L的多糖樣品溶液與6.0 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol/L，pH 7.4）、1.0 mL 50 mmol/L H2O2溶液混合，搖勻，10 min后以蒸餾水為空白對照于230 nm波長處測定吸光度。

多糖對H2O2的清除率

E2=[1—（A1—A2）/A3]×100% （2）

式中，A1為試驗體系的吸光度；A2為只含多糖溶液的吸光度；A3為只含H2O2溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 回流時間對葛根多糖提取率的影響 回流時間對葛根多糖提取率的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，回流時間從0.5 h延長到1.0 h，葛根多糖提取率迅速上升，之后再延長回流時間，提取率反而下降?？赡苁怯捎诨亓鲿r間過長導致雜質(zhì)過多，且已溶出的多糖易在加熱條件下分解，因此以下單因素試驗回流時間均為1.0 h。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對葛根多糖提取率的影響 葛根多糖提取率隨乙醇體積分數(shù)變化而變化的結(jié)果見圖3。由圖3可知，多糖提取率隨乙醇體積分數(shù)的升高呈先上升后下降的趨勢。乙醇體積分數(shù)為80%時多糖提取率最大，乙醇體積分數(shù)進一步增大，多糖提取率下降。這可能是因為高濃度乙醇會造成葛根渣纖維收縮，使多糖溶出困難。因此以下單因素試驗均以體積分數(shù)80%的乙醇為提取劑。

2.1.3 料液比對葛根多糖提取率的影響 料液比對葛根多糖提取率的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，多糖提取率隨著料液比的減小先增加，在料液比為1∶40時最大，此時大部分多糖已溶出，再增加提取劑的用量，多糖提取率增加不明顯，甚至有所降低，且不利于后續(xù)多糖的濃縮和提純。

2.1.4 回流溫度對葛根多糖提取率的影響 回流溫度對葛根多糖提取率的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，回流溫度低于90 ℃時，提取率隨著溫度的升高而緩慢升高，溫度高于90 ℃時提取率有所下降。可見較高的提取溫度有利于多糖的溶出，但過高的溫度會導致多糖的降解，反而不利于提高提取率。

2.2 正交試驗結(jié)果

從正交試驗結(jié)果（表2）可知，4個因素對葛根多糖提取率的影響由大到小依次為乙醇體積分數(shù)、料液比、回流溫度、回流時間。最佳試驗組合為A3B1C3D3，即回流時間2.0 h、乙醇體積分數(shù)75%、料液比1∶40、回流溫度95 ℃。按此條件進行驗證試驗，葛根多糖提取率為1.209%，高于所有正交試驗組合的提取率結(jié)果，可見優(yōu)化的試驗方案是可靠的。

2.3 葛根多糖的抗氧化作用測定結(jié)果

2.3.1 葛根多糖對超氧陰離子自由基（O2—·）的清除作用 不同濃度葛根多糖對O2—·的清除率見圖6。由圖6可以看出，葛根多糖對鄰苯三酚自氧化反應產(chǎn)生的O2—·具有一定的清除作用，且隨多糖濃度的增加清除效果增強。多糖濃度為200 mg/L時，其對O2—·的清除率為18.52%。

2.3.2 葛根多糖對過氧化氫（H2O2）的清除作用 不同濃度葛根多糖對H2O2的清除作用結(jié)果見圖7。由圖7可以看出，葛根多糖對H2O2具有一定的清除作用，且隨多糖濃度的增加清除效果增強。多糖濃度為200 mg/L時其對H2O2的清除率為13.68%。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗和正交設計確定乙醇回流法從葛根渣中提取葛根多糖的最佳工藝條件為回流時間2.0 h、乙醇體積分數(shù)75%、料液比1∶40、回流溫度95 ℃。所得提取液對碘—碘化鉀反應呈陰性，說明其中不含淀粉。按此條件提取的葛根多糖對O2—·和H2O2均具有一定的清除能力，且在試驗范圍內(nèi)清除效果隨著多糖濃度的升高而增強。多糖濃度為200 mg/L時，其對O2—·和H2O2的清除率分別為18.52%和13.68%。

參考文獻：

[1] 劉義鵑，宛曉春.葛根資源的開發(fā)與利用[J].中國林副特產(chǎn)，1998（2）：40—41.

[2] 中國科學院植物研究所. 中國高等植物圖鑒：第二冊[M].北京：科學出版社，1985.502.

[3] 于淑池，蘇 濤，楊建民，等.安吉白茶多糖對實驗性糖尿病小鼠的降血糖作用研究[J].茶葉科學，2010，30（3）：223—228.

[4] 李俊麗，向長萍. 南瓜水溶性多糖提取及抗氧化性能的研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2006，45（5）：611—614.

[5] 孫元琳，藺毅峰，高文庚，等. 當歸多糖抗輻射功能的構(gòu)效關(guān)系探討[J]. 中國食品學報，2009，9（3）：33—37.

[6] 張英慧，曲愛琴，宋劍秋. 海帶多糖FGS對小鼠巨噬細胞細胞毒活性的影響[J]. 免疫學雜志， 2002，18（5）：403—405.

[7] MATSUMOTO T，KIYOHARA H，YAMAD H，et al. The pectic polysaccharide from Bupleurum falcatum L. enhances elearance of immune complexes in mice[J]. Phytotherapy Research，1996， 10（7）：585—588.

[8] 李福香，徐 敏，王 鍵，等.肉蓯蓉的藥理學研究現(xiàn)狀與展望[J].安徽農(nóng)學通報，2006，12（13）：92—93.

[9] YUAN H M， ZHANG W W， LI X G， et al. Preparation and in vitro antioxidant activity of κ—carrageenan oligosaccharides and their oversulfated， acetylated， and phosphorylated derivatives[J]. Carbohydrate Research，2005，340（4）：685—692.

[10] 王文果，龐 杰.多糖涂膜保鮮果蔬的研究進展[J].山地農(nóng)業(yè)生物學報，2006，25（4）：358—363.

[11] 董彩婷，楊 青，肖元梅，等.蘆薈多糖抗突變作用的試驗研究[J]. 華西醫(yī)科大學學報，2002，33（3）：477—478.

[12] 張惟杰.糖復合物生化研究技術(shù)[M].杭州：浙江大學出版社，1999.132—136.

[13] 何玲玲，王 新，劉 彬，等. 板栗多糖的分離純化及抗氧化活性研究[J].食品與機械，2010，26（2）：72—75.