摘要：采用乙醇回流法從葛根（Radix Puerariae）渣中提取葛根多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化多糖提取工藝，并測(cè)定提取的葛根多糖的抗氧化活性。結(jié)果表明，優(yōu)化的乙醇回流法提取葛根多糖的工藝條件為回流時(shí)間2.0 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶40（m∶V，g/mL）、回流溫度95 ℃，葛根多糖提取率為1.209%。提取的葛根多糖對(duì)O2—·和H2O2均有一定的清除作用，濃度為200 mg/L時(shí)，其對(duì)O2—·和H2O2的清除率分別為18.52%和13.68%。

關(guān)鍵詞：葛根（Radix Puerariae）渣；多糖；乙醇回流法；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：O629.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439—8114（2012）19—4344—04

葛根（Radix Puerariae）是多年生藤本植物野葛（Pueraria lobata）的根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉等功效[1]。中國(guó)葛根資源極為豐富，除新疆、西藏、青海外，各省均有分布[2]。目前對(duì)葛根的研究和利用尚處于起步階段，主要是從葛根中提取淀粉和黃酮類化合物，提取之后剩下大量的葛根渣。葛根渣含有大量粗纖維及多糖等營(yíng)養(yǎng)成分，但是喂豬不消化，作肥不腐爛，隨意傾倒又造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)，加強(qiáng)葛根渣的綜合利用是葛根加工業(yè)中一個(gè)亟需解決的重要問題。

大量藥理及臨床研究證實(shí)，多糖具有多種生物學(xué)功能，如降血糖作用[3]、提高機(jī)體的免疫功能[4]、抗輻射[5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、抗衰老[8]、抗氧化活性[9]、保鮮[10]、抗突變[11]等。本研究以乙醇溶液為提取溶劑，通過加熱回流方式從葛根渣中提取多糖，優(yōu)化提取工藝并測(cè)定其抗氧化活性，旨在為葛根多糖的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗(yàn)儀器：UV—2102.PC型紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司），SSW型微電腦電熱恒溫水槽（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），電子天平（梅特勒—托利多儀器上海有限公司），微量移液器（上海榮泰生化工程有限公司），SHZ—III型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）。

試驗(yàn)試劑濃硫酸、苯酚、葡萄糖、鄰苯三酚、Tris等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

試驗(yàn)材料野生葛根渣取自上饒縣農(nóng)戶，為葛根提取葛粉之后曬干的殘?jiān)?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苯酚—硫酸法制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[12] 分別取0.506 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于試管中，加水補(bǔ)至2.0 mL，另一試管加入2.0 mL蒸餾水作為空白對(duì)照。各試管分別加入60 mg/mL的苯酚1.0 mL，然后迅速加入98%的濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置5 min，置沸水浴中水浴15 min。取出冷卻至室溫后于490 nm處測(cè)定其吸光度。以葡萄糖溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖在0～0.253 0 mg/mL范圍內(nèi)濃度（X//mg/mL）與吸光度（A490 nm）呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=5.814 2X+0.114 3，r=0.990 8。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取干燥的葛根渣5 g，加入一定體積的乙醇溶液，在一定溫度下加熱回流一定時(shí)間后過濾，收集濾液，定容至100 mL，制得樣液，參照“1.2.1”的方法測(cè)其吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品溶液中多糖的濃度，并計(jì)算葛根多糖提取率。設(shè)置單因素試驗(yàn)考察回流時(shí)間、加熱溫度、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)多糖提取率的影響。①回流時(shí)間。在回流溫度80 ℃、料液比1∶20（m∶V，g/mL，下同）、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%的條件下分別回流0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。②乙醇體積分?jǐn)?shù)。分別采用體積分?jǐn)?shù)75%、80%、85%、90%的乙醇作為提取劑，在回流溫度80 ℃、料液比1∶20的條件下回流1 h。③料液比?；亓鳒囟?0 ℃、分別按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的料液比加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇，回流1 h。④回流溫度。按1∶40的料液比加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇，分別在80、85、90、95 ℃回流1 h。

1.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，因素與水平見表1。

1.2.4 葛根多糖還原能力的測(cè)定[13]

1）對(duì)超氧陰離子自由基（O2—·）的清除作用。將按最佳工藝條件提取得到的多糖溶液配制成20、40、80、200 mg/L的溶液。取50 mmol/L pH 8.2的Tris—HCl緩沖溶液（含1 mmol/L EDTA）7.0 mL，加入1.0 mL去離子水，混勻后25 ℃水浴20 min，取出后立即加入1.0 mL 25 ℃預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚，混勻后立即倒入比色池，以蒸餾水為空白對(duì)照，于325 nm處每隔30 s測(cè)定一次吸光度，共測(cè)定5 min，其吸光度隨時(shí)間的變化率記作A；在加入鄰苯三酚前先加入1.0 mL不同濃度的多糖溶液，其吸光度隨時(shí)間的變化記作B。

多糖對(duì)O2—·的清除率E1=（1—A/B）×100% （1）

2）對(duì)過氧化氫（H2O2）的清除作用。4份1 mL濃度分別為20、40、80、200 mg/L的多糖樣品溶液與6.0 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol/L，pH 7.4）、1.0 mL 50 mmol/L H2O2溶液混合，搖勻，10 min后以蒸餾水為空白對(duì)照于230 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

多糖對(duì)H2O2的清除率

E2=[1—（A1—A2）/A3]×100% （2）

式中，A1為試驗(yàn)體系的吸光度；A2為只含多糖溶液的吸光度；A3為只含H2O2溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 回流時(shí)間對(duì)葛根多糖提取率的影響 回流時(shí)間對(duì)葛根多糖提取率的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，回流時(shí)間從0.5 h延長(zhǎng)到1.0 h，葛根多糖提取率迅速上升，之后再延長(zhǎng)回流時(shí)間，提取率反而下降?？赡苁怯捎诨亓鲿r(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致雜質(zhì)過多，且已溶出的多糖易在加熱條件下分解，因此以下單因素試驗(yàn)回流時(shí)間均為1.0 h。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根多糖提取率的影響 葛根多糖提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變化而變化的結(jié)果見圖3。由圖3可知，多糖提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)多糖提取率最大，乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增大，多糖提取率下降。這可能是因?yàn)楦邼舛纫掖紩?huì)造成葛根渣纖維收縮，使多糖溶出困難。因此以下單因素試驗(yàn)均以體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇為提取劑。

2.1.3 料液比對(duì)葛根多糖提取率的影響 料液比對(duì)葛根多糖提取率的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，多糖提取率隨著料液比的減小先增加，在料液比為1∶40時(shí)最大，此時(shí)大部分多糖已溶出，再增加提取劑的用量，多糖提取率增加不明顯，甚至有所降低，且不利于后續(xù)多糖的濃縮和提純。

2.1.4 回流溫度對(duì)葛根多糖提取率的影響 回流溫度對(duì)葛根多糖提取率的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，回流溫度低于90 ℃時(shí)，提取率隨著溫度的升高而緩慢升高，溫度高于90 ℃時(shí)提取率有所下降?？梢娸^高的提取溫度有利于多糖的溶出，但過高的溫度會(huì)導(dǎo)致多糖的降解，反而不利于提高提取率。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

從正交試驗(yàn)結(jié)果（表2）可知，4個(gè)因素對(duì)葛根多糖提取率的影響由大到小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、回流溫度、回流時(shí)間。最佳試驗(yàn)組合為A3B1C3D3，即回流時(shí)間2.0 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶40、回流溫度95 ℃。按此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，葛根多糖提取率為1.209%，高于所有正交試驗(yàn)組合的提取率結(jié)果，可見優(yōu)化的試驗(yàn)方案是可靠的。

2.3 葛根多糖的抗氧化作用測(cè)定結(jié)果

2.3.1 葛根多糖對(duì)超氧陰離子自由基（O2—·）的清除作用 不同濃度葛根多糖對(duì)O2—·的清除率見圖6。由圖6可以看出，葛根多糖對(duì)鄰苯三酚自氧化反應(yīng)產(chǎn)生的O2—·具有一定的清除作用，且隨多糖濃度的增加清除效果增強(qiáng)。多糖濃度為200 mg/L時(shí)，其對(duì)O2—·的清除率為18.52%。

2.3.2 葛根多糖對(duì)過氧化氫（H2O2）的清除作用 不同濃度葛根多糖對(duì)H2O2的清除作用結(jié)果見圖7。由圖7可以看出，葛根多糖對(duì)H2O2具有一定的清除作用，且隨多糖濃度的增加清除效果增強(qiáng)。多糖濃度為200 mg/L時(shí)其對(duì)H2O2的清除率為13.68%。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)確定乙醇回流法從葛根渣中提取葛根多糖的最佳工藝條件為回流時(shí)間2.0 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶40、回流溫度95 ℃。所得提取液對(duì)碘—碘化鉀反應(yīng)呈陰性，說明其中不含淀粉。按此條件提取的葛根多糖對(duì)O2—·和H2O2均具有一定的清除能力，且在試驗(yàn)范圍內(nèi)清除效果隨著多糖濃度的升高而增強(qiáng)。多糖濃度為200 mg/L時(shí)，其對(duì)O2—·和H2O2的清除率分別為18.52%和13.68%。

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