摘要：從草魚腸道中分離篩選出6株產(chǎn)木聚糖酶的菌株，從中挑選產(chǎn)酶量最大的菌株測(cè)定酶液活力，并采用殼聚糖、海藻酸鈉等固定游離酶。結(jié)果表明，與游離酶相比，殼聚糖固定酶的最適pH向堿性方向偏移，海藻酸鈉固定酶的最適pH向酸性方向偏移。與游離酶相比，固定化酶有較高的最適溫度和較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：木聚糖酶；菌株分離；固定化

中圖分類號(hào)：Q556+2；Q814.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439—8114（2012）19—4337—03

木聚糖是自然界中含量?jī)H次于纖維素的多聚糖，是半纖維素的主要成分，其水解后可生成低聚木糖與木糖單體。低聚木糖是由2～7個(gè)木糖以β—1，4糖苷鍵結(jié)合而成的功能性低聚糖，可被動(dòng)物體內(nèi)的雙歧桿菌等益生菌利用[1]，從而促進(jìn)有益菌的增殖，提高動(dòng)物的免疫力[2]，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收[3]。木聚糖酶是一組可將木聚糖分解為低聚木糖和木糖的復(fù)合酶系，廣泛用于飼料、食品、能源、造紙、生物轉(zhuǎn)化等行業(yè)[4]。木聚糖酶可由細(xì)菌、放線菌、真菌等多種微生物產(chǎn)生，但不同來源的微生物產(chǎn)生木聚糖酶的類型和性質(zhì)不同。目前已報(bào)道的產(chǎn)木聚糖酶的微生物大多數(shù)為來自陸生環(huán)境的曲霉、木霉、芽孢桿菌等[5]，來源于水環(huán)境，特別是淡水魚體內(nèi)的產(chǎn)木聚糖酶的菌株鮮見報(bào)道。由于來源于陸生菌株的木聚糖酶作用條件與淡水魚的生活環(huán)境、消化道條件不完全適應(yīng)，在使用中存在著穩(wěn)定性和耐熱性差等缺點(diǎn)[6]，限制了木聚糖酶的廣泛使用，因此開發(fā)適用于淡水魚水體環(huán)境的木聚糖酶尤為必要。本研究在篩選來源于淡水魚的產(chǎn)木聚糖酶菌株的基礎(chǔ)上，研究了木聚糖酶的固定化及外界因素對(duì)固定化酶的影響，為木聚糖酶的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用草魚購(gòu)于江西宜春農(nóng)戶養(yǎng)殖池塘。

培養(yǎng)基：①選擇培養(yǎng)基：木聚糖10 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，MgSO4 0.3 g，NH4NO3 5 g，K2HPO4 2 g，（NH4）2SO4 1 g，酵母粉0.3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。②基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：麩皮40 g，蛋白胨5 g，K2HPO4 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1%木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取木糖1.000 g，加入80 mL pH 5.0的磷酸二氫鈉—檸檬酸緩沖液，水浴加熱至溶解，冷卻后用緩沖液定容至100 mL，冷藏備用。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的分離 無菌條件下取草魚腸道，研磨，稀釋后涂布于選擇培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h。挑取具有透明圈的菌落分離純化，直至得到純培養(yǎng)物。將純培養(yǎng)物接種于選擇培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h后測(cè)定透明圈的直徑與菌落的直徑，計(jì)算兩者比值，挑選比值最大的菌株進(jìn)行酶的固定化研究。

1.2.2 待測(cè)酶液的制備 將1.2.1分離的產(chǎn)酶菌株接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，離心，取上清。上清液過濾后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 固定化木聚糖酶的制備 ①殼聚糖對(duì)木聚糖酶的固定。取1 g殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)3%的乙酸中，得黏稠狀液體，用注射器將液體注入1 mol/L氫氧化鈉—甲醇溶液（V氫氧化鈉∶V甲醇∶V去離子水=2∶3∶5）中，形成光滑的殼聚糖微球載體，微球洗至中性后加入體積分?jǐn)?shù)1%的戊二醛溶液中，室溫磁力攪拌器攪拌5 h，使之完全硬化，水洗、抽濾后洗去未偶聯(lián)的戊二醛，取出微球載體，加入50 mL木聚糖酶液，攪拌，洗滌以除去未被固定的游離酶，固定化酶于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。②海藻酸鈉對(duì)木聚糖酶的固定。取游離酶液15 mL與150 mL 30 g/L的海藻酸鈉溶液混合攪拌，再加入150 mL 30 g/L的明膠溶液，注入到20 g/L的氯化鈣溶液中，立刻形成光滑的微球。靜置1 h后用生理鹽水反復(fù)洗滌，去除游離酶，固定化酶于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 酶活力的測(cè)定 DNS法測(cè)定酶活力[7]，6支比色管中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 10 g/L的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以pH 5.0的醋酸鹽緩沖液補(bǔ)齊至2 mL，加入3 mL DNS試劑，沸水浴15 min，流水冷卻，蒸餾水稀釋至25 mL混勻，以未加木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的處理作對(duì)照，于540 nm處測(cè)吸光度[7]。得到木糖濃度X（μg/mL）對(duì)吸光度Y（OD540 nm）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.994 5X—0.161 7， R2=0.991 3。以1 min催化水解木聚糖生成1 μmol木糖所相當(dāng)?shù)拿噶繛?個(gè)酶活單位。

U=C×Df×V/（M×t）

式中，C為酶解后溶液中木糖的濃度（μg/mL），Df為待測(cè)酶液的稀釋倍數(shù)，V為反應(yīng)液體積（mL），M為木糖的摩爾質(zhì)量（g/mol），t為反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.2.5 不同反應(yīng)條件對(duì)酶活力的影響 ①pH。用pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的緩沖液溶解木聚糖酶液，30 ℃水浴，DNS法測(cè)定固定化酶與游離酶的酶活力。②溫度。pH 5.0條件下，分別在10、20、30、40、50、60 ℃水浴，DNS法測(cè)定固定化酶與游離酶的酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選

挑選具有透明水解圈的菌落分離純化，最終得到6株細(xì)菌，編號(hào)為M1—M6。在選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，6株菌株透明圈的直徑與菌落直徑的比值依次為2.4、1.6、2.0、1.3、1.1、1.5。產(chǎn)酶量與比值呈正相關(guān)，可見菌株M1產(chǎn)酶量較大，后續(xù)試驗(yàn)以M1菌株為研究對(duì)象，考察溫度和pH對(duì)固定酶及游離酶酶活力的影響。

2.2 pH對(duì)酶活力的影響

不同pH條件下殼聚糖固定酶、海藻酸鈉固定酶及游離酶的酶活力見圖1。由圖1可知，3種形態(tài)酶的最適pH均不同，游離酶的最適pH為5.0，而殼聚糖固定酶和海藻酸鈉固定木聚糖酶的最適pH分別為5.5和4.5?？梢娡坞x酶相比，用不同的包埋劑固定酶時(shí)通常引起酶的最適pH出現(xiàn)不同方向和程度的偏移[8，9]。

2.3 溫度對(duì)酶活力的影響

殼聚糖固定酶、海藻酸鈉固定酶及游離酶在不同溫度下的酶活力見圖2。從圖2可以看出，3種酶的酶活力都先隨著溫度升高而升高，達(dá)到最大酶活力后隨著溫度的升高又逐漸下降。殼聚糖固定酶和海藻酸鈉固定酶的酶活力均在40 ℃時(shí)最高，高于游離酶的最適溫度30 ℃?？傮w而言，固定化酶的活力在20～60 ℃范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，其隨溫度變化而變化的趨勢(shì)較游離酶平緩，這可能是由于固定化酶具有更加穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。酶固定化后最適溫度升高的現(xiàn)象比較普遍，王瑾等[10]用海藻酸鈉與殼聚糖固定β—半乳糖苷酶后發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)溫度比游離酶提高了10 ℃，周建芹等[11]研究發(fā)現(xiàn)固定化蒜氨酸酶比游離酶的最適溫度提高了5 ℃。本研究的殼聚糖固定酶和海藻酸鈉固定酶有較好的熱穩(wěn)定性，60 ℃時(shí)能保持相對(duì)酶活的60%以上。但相對(duì)其他酶的固定化研究[10，12]，該固定化酶的耐熱能力不強(qiáng)，可能與產(chǎn)生木聚糖酶的微生物生活環(huán)境有關(guān)。本研究所得的游離木聚糖酶最適溫度為30 ℃，與水體中嗜溫微生物的最適生長(zhǎng)溫度一致。

3 小結(jié)與討論

木聚糖酶主要應(yīng)用于食品、飼料、能源、醫(yī)藥等領(lǐng)域。不同領(lǐng)域?qū)δ揪厶敲傅囊蟛煌瑧?yīng)用于飼料添加劑中的木聚糖酶要求能耐受飼料加工過程的高溫，且能在動(dòng)物的消化道內(nèi)保持較高活力。不同微生物產(chǎn)生的木聚糖酶不同，所適合的用途也不同。本研究從淡水魚類草魚腸道中分離產(chǎn)木聚糖的微生物，得到比較適合淡水魚類的木聚糖酶制劑。酶的固定化具有成本低、成功率高、方法簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)，本研究采用殼聚糖、海藻酸鈉兩種不同的材料固定所獲取的酶，結(jié)果表明，固定化酶有更高的耐熱性和更廣的pH適應(yīng)范圍。海藻酸鈉固定化酶與殼聚糖固定化酶的最適pH偏移的方向不同，可根據(jù)不同動(dòng)物的生存環(huán)境及胃腸道的pH選擇不同的包埋劑。今后可通過基因重組、酶的固定化等手段進(jìn)一步提高酶的耐熱性，促進(jìn)其在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用。

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