摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳，在試驗水溫23～25 ℃的條件下，研究了乙烯利（ETH）對泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）5種組織酯酶（EST）同工酶表達的影響。結果表明，經不同濃度乙烯利處理后，在不同染毒時間下泥鰍5種組織EST同工酶酶譜發(fā)生了不同程度的變化，變化的類型包括：酶帶的缺失、新增及著色的深淺，5種組織EST同工酶的表達具有明顯的組織差異性，活性由強至弱依次為：脾臟>肝胰臟>鰓>心臟>肌肉；沒有發(fā)現(xiàn)劑量梯度與EST同工酶表達的正相關變化，在不同染毒時間下，脾臟、肝胰臟、鰓組織EST同工酶基本上表現(xiàn)為在24 h活性增強，48 h活性達到最弱，72 h略有增強，96 h又減弱，而心臟和肌肉組織24 h先增強，而后一直減弱的趨勢，表現(xiàn)出明顯的組織差異性和應激性。

關鍵詞：泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）；乙烯利；組織；酯酶；同工酶

中圖分類號：X503.225；R155.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439—8114（2012）19—4325—05

乙烯與果實成熟有著密切的關系，被認為是果實成熟激素。乙烯利（Ethrel，ETH）化學名稱為2—氯代乙基膦酸，是一種人工合成的乙烯釋放劑，其作為植物生長調節(jié)劑具有用量小、見效快、殘留少等特點，廣泛用于保護地反季節(jié)早熟植物栽培[1—3]。近年來，由于存在乙烯利的濫用及隨意提高使用濃度、盲目改變使用時間等現(xiàn)象，乙烯利在果蔬中的殘留已經成為影響果蔬食用安全的因素之一[4]。另有研究表明[5]，乙烯利具有一定的神經毒性和弱激素樣作用。國外對水果、蔬菜中殘留的乙烯利有嚴格的限量要求，歐盟最新規(guī)定其最高殘留限量為0.02 mg/kg[6]。于文輝等[4]研究表明，乙烯利對小鼠體細胞和生殖細胞具有致突變作用。但關于乙烯利對魚類組織同工酶表達的影響目前鮮見報道。

同工酶技術可指示一些具有特異性的同工酶帶，定性地反映環(huán)境中的污染物。酯酶（EST）同工酶能水解大量非生理存在的酯類化合物，包括某些藥物，具有解毒作用。在環(huán)境毒物存在的情況下，多種動植物EST同工酶的表達都會有顯著的變化[7]。環(huán)境科學多采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法研究環(huán)境污染物對生物同工酶表達的影響[8，9]。本研究采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，在水溫23～25 ℃的條件下，研究了乙烯利對泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）5種組織EST同工酶表達的影響，旨在為生活生產中合理使用乙烯利提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用泥鰍購自世紀華聯(lián)超市，選擇體格健壯、體表無傷、規(guī)格一致的泥鰍，平均體長為（14.56±0.35） cm，平均體重為（27.00±0.26） g。試驗前將泥鰍放入曝氣自來水中馴養(yǎng)1周，每天換1次水。乙烯利（分析純）購自上?；瘜W試劑采購供應五聯(lián)化工廠。

1.2 方法

1.2.1 染毒試驗 根據急性毒性試驗結果，以96 h全部存活濃度為最低濃度，全部致死濃度為最高濃度，將試驗分為3個試驗組和1個空白對照組，每組15尾泥鰍。試驗組乙烯利濃度依次為0.06、0.07、0.08 mg/L，空白對照組不添加乙烯利。染毒試驗在室內容積為10 L的棕色玻璃缸中進行，每個玻璃缸加入相應處理液4 L，對照組加入曝氣自來水，每24 h換液1次。染毒時間為96 h。試驗期間不投餌，僅用簡易增氧機進行增氧，水溫23～25 ℃，pH 7.3，發(fā)現(xiàn)死亡個體及時清除。

1.2.2 采樣 每隔24 h分別從對照組和各試驗組隨機撈取2尾泥鰍，擦干體表水分，將泥鰍置于盛滿冰的解剖盤上解剖，取出心、鰓、脾、肝胰臟、肌肉5種組織，用預冷的無菌蒸餾水沖洗以除去組織血污，然后用濾紙吸去多余水分。分別取上述5種組織稱重，將組織放入研缽按1∶2的比例（質量體積比，g/mL）加入0.02 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，置于冰上研磨成糊狀勻漿。將研磨好的組織倒入離心管中，4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，取上清液于—20 ℃保存，供同工酶電泳分析用。

1.2.3 電泳 采用周宗漢等[10]的方法制備凝膠，濃縮膠濃度為3.0%，分離膠濃度為7.4%，電極緩沖液為Tris—甘氨酸溶液（pH 8.3）。每孔點樣量為10 μL。電泳時，指示劑（溴酚藍）在濃縮膠內時用70 V電壓，當指示劑完全進入分離膠后，將電壓升高到150 V，電流控制在15 mA。電泳時間為8 h左右。整個電泳過程于4 ℃進行。

1.2.4 染色 染色液配方參照季維智等[11]的方法。電泳結束后將凝膠取出，用蒸餾水沖洗干凈，放入基質染色液中染色，直至清晰條帶出現(xiàn)（約5～10 min）。顯色完成后用蒸餾水將凝膠沖洗干凈，然后用7%的冰醋酸溶液固定、75%的乙醇脫色，數碼相機拍照。

1.2.5 同工酶的命名 同工酶酶譜的命名以同工酶縮寫名稱的大寫代表酶蛋白，按從陰極到陽極電泳遷移的方向依次命名。

2 結果與分析

2.1 乙烯利對泥鰍脾臟EST同工酶表達的影響

由圖1和表1可見，正常情況下泥鰍脾臟EST同工酶共有4條酶帶表達，分別為Est—4、Est—5、Est—6、Est—7，其中Est—4的活性很強，Est—6和Est—7活性較弱。經乙烯利染毒處理后，泥鰍脾臟EST同工酶酶帶遷移率（Rf）分布在0.297～0.803，大多集中在0.406～0.495。在不同染毒時間下，3個試驗組有2條共有酶帶，即Est—4和Est—5。低濃度組（A組）在24 h和96 h時分別有Est—7和Est—6出現(xiàn)，且活性均較弱；在96 h時誘導出Est—2，但活性較弱。中濃度組（B組）在整個染毒過程中均有Est—3、Est—4和Est—5表達，在24 h和48 h時誘導出Est—8。高濃度組（C組）僅在24 h時有Est—6表達，在72 h時誘導出Est—2，但活性較弱。

2.2 乙烯利對泥鰍肝胰臟EST同工酶表達的影響

由圖2和表2可見，正常情況下泥鰍肝胰臟EST同工酶有Est—3、Est—4、Est—5共3條酶帶表達，三者活性較一致。經乙烯利染毒處理后，低濃度組（A組）各條帶表達較好，但是在48 h時條帶明顯減少并且活性減弱，僅有Est—3、Est—5表達，可能是泥鰍個體差異導致。隨著染毒時間的延長，中濃度組（B組）酶帶數目趨于增多，并且在96 h時誘導出了惟一的Est—1（Rf =0.382）。高濃度組（C組）EST同工酶活性隨著染毒時間的延長逐漸減弱，但在96 h時活性有所增強，可能是肝胰臟EST對高濃度乙烯利的應激作用?？傮w來說，48 h時3個試驗組的酶帶最少，顏色較淺，表明酶活性較弱，96 h時酶帶最多。

2.3 乙烯利對泥鰍鰓EST同工酶表達的影響

由圖3和表3可見，正常情況下泥鰍鰓EST同工酶有3條酶帶表達，分別為Est—2、Est—3、Est—4。經乙烯利染毒處理后，隨著乙烯利濃度的升高及染毒時間的延長，同工酶條帶數和活性發(fā)生了一些變化，但條帶總體上分布比較集中，Rf在0.410～0.495，部分低濃度組（A3和A4）及全部中濃度組（B組）都誘導出Est—1，其活性被激發(fā)，Est—4只在對照組及B3、C3組有表達。泥鰍鰓EST同工酶在24 h時活性逐漸增強，48 h時稍有減弱，到72 h時酶帶顏色較深、寬度較寬，酶活性較強，96 h時酶活性又有所減弱。乙烯利對鰓EST同工酶表達的影響主要表現(xiàn)為：在一定濃度下對部分酶帶的抑制（Est—4）或誘導（Est—1），其活性變化不大。

2.4 乙烯利對泥鰍心臟EST同工酶表達的影響

由圖4和表4可見，正常情況下泥鰍心臟EST同工酶共有3條酶帶表達，分別為Est—2、Est—3、Est—4，其中Est—2活性較強。與鰓組織相似，心臟EST同工酶酶帶分布也比較集中，Rf在0.363～0.437。低濃度組（A組）在24 h與48 h下表達Est—2、 Est—3兩條酶帶，在72 h和96 h時誘導出Est—1，但活性較弱。中濃度組（B組）在24 h時誘導出Est—1，且活性較強，在48 h和96 h時均僅有Est—1表達，其他3條酶帶缺失。而高濃度（C組）在96 h時誘導出Est—1，且活性很強。從24 h至72 h，心臟EST同工酶活性呈逐漸減弱的趨勢，至96 h時活性又有所增強。

2.5 乙烯利對泥鰍肌肉EST同工酶表達的影響

由圖5和表5可見，正常情況下泥鰍肌肉EST同工酶共有3條酶帶表達，其中Est—2活性很強，推測與心臟一樣，肌肉EST的含量也較少。肌肉EST同工酶Rf在0.394～0.500，條帶分布較集中。低濃度組（A組）在24、48及96 h時均表達Est—2和 Est—3兩條酶帶，但在72 h時僅表達Est—4，且活性較弱。中濃度組（B組）在整個染毒過程中均有Est—1和 Est—3表達，且活性較弱；在24 h和96 h時Est—2表達強烈，其活性與對照組相當。高濃度組（C組）僅在24 h時Est—2的活性很強；在72 h時誘導出Est—1，但活性較弱。

3 討論

EST是生物體內催化羧酸酯類化合物水解和合成的一類酶，具有明顯的多態(tài)性、高度的組織特異性和種族特異性[7]。EST同工酶是生物體內的天然標記之一。靳曉敏等[12]采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板不連續(xù)電泳法分析了高效反式氯氰菊酯和功夫菊酯在不同注射劑量、不同攻毒時間條件下對鯉肝胰臟EST同工酶的影響，結果表明注射不同劑量農藥攻毒后，在不同攻毒時間下EST同工酶酶譜發(fā)生了不同程度的變化，變化的類型包括：酶帶的缺失、新增及著色的深淺，這與本研究的結果一致。本研究表明，對照組除脾臟EST同工酶表達4條酶帶外，其余4種組織均為3條，而經乙烯利染毒處理后，各組織EST同工酶表現(xiàn)出明顯的組織特異性，根據酶帶數目和染色的深淺，各組織EST同工酶活性強弱順序為：脾臟>肝胰臟>鰓>心臟>肌肉。據此推測，乙烯利對泥鰍脾臟的損害作用最強，對肌肉損害最弱。其中，脾臟與其他組織相比，酶帶遷移率極差最大、酶帶數目最多、染色最深，表明其活性也最強。尹紹武等[13]對褐點石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）不同組織4種同工酶研究發(fā)現(xiàn)，肝臟的EST同工酶酶帶最多、活性最強。賈秀英等[14]研究了不同濃度的鉛對蟾蜍（Bufobufo gargarizans）肝臟、腎臟過氧化物酶和EST同工酶的影響，結果表明不同濃度的鉛均可使肝、腎組織過氧化物酶同工酶活性發(fā)生明顯變化；對肝、腎EST同工酶的影響表現(xiàn)出一定的組織差異性，且在一定范圍內主要表現(xiàn)為應激性，即低劑量的鉛可誘導酶活性的升高。而本研究發(fā)現(xiàn)，脾臟EST同工酶活性在5種組織中最強，其原因可能是由于脾臟參與體液免疫和炎癥反應，對內源性或外源性異物進行貯存、破壞或脫毒有關[15]。肝胰臟EST同工酶的酶帶集中、染色較深，但酶帶數目沒有脾臟多，可能是因為肝胰臟是解毒器官，與其解毒功能有關。鰓EST同工酶的表達與肝胰臟相比較弱，但其酶帶染色較深、分布較集中。正常情況下，心臟與肌肉都只有3條酶帶，且活性較弱。牛紅星等[16]研究了毛腿鼠耳蝠（Myotis fimbriatus）不同組織EST同工酶的特異性，結果發(fā)現(xiàn)心臟和胸肌僅表達3條相同的酶帶，且酶活性相近，推測可能與心臟和肌肉中EST含量較少有關。

王蘭等[15]研究了鎘對中華絨螯蟹（Sinopotamon yangtsekiense）組織器官EST同工酶的影響，認為其同工酶表達不僅具有組織特異性，而且與積累量有關。而本研究沒有發(fā)現(xiàn)劑量梯度與EST同工酶表達的正相關變化。在不同染毒時間處理下，心臟和肌肉組織EST同工酶活性在24 h時先增強，而后一直呈減弱趨勢，至96 h時活性又有所增強。出現(xiàn)這種情況可能是乙烯利刺激了機體的應激機制，機體通過增加EST酶帶數量來增加對抗異物入侵所需的能量，表現(xiàn)出明顯的應激性，但機體的應激能力是有限的，當超過其忍受限度時EST同工酶的表達被抑制，至96 h時EST同工酶活性又有所增強，表明機體對環(huán)境產生了一定的適應性；而脾臟、肝胰臟、鰓3種組織EST同工酶基本上在24 h時活性先增強，48 h時活性達到最弱，72 h時略有增強，96 h時又減弱，其可能原因與不同組織所執(zhí)行的生理功能有密切關系。

本試驗研究了在外界環(huán)境下一定濃度的乙烯利對泥鰍不同組織EST同工酶的影響，乙烯利的濃度為0.06、0.07、0.08 mg/mL，其中0.06 mg/mL與0.08 mg/mL分別為預試驗中泥鰍96 h全部存活與全部死亡的濃度，若要得出乙烯利在泥鰍體內的限量，可采用體內注射的方式進一步研究EST活性變化。

參考文獻：

[1] 劉文燕，李振國，羅文華，等.乙烯利對香蕉、柑桔、柿子果實的催熟作用[J].植物生理學通訊，1980（4）：38—41.

[2] 李媛媛.乙烯利處理對黃瓜農藝性狀和生理生化特性的影響[J]. 安徽農業(yè)科學，2010，38（32）：18102—18104.

[3] 趙 文，劉一峰，孟玉彩，等.乙烯利對小鼠的免疫毒性研究[J]. 農藥學學報，2008，10（2）：217—220.

[4] 于文輝，高永泉，趙 文，等.乙烯利體內致突變性研究[J].農藥學學報，2006，8（2）：184—186.

[5] 王 蓓，趙 文，梁淑珍，等.乙烯利對昆明種小鼠的氧化應激作用[J].農藥學學報，2010，12（1）：97—100.

[6] 金 抗.乙烯利中毒致多器官功能障礙1例[J].中國急救醫(yī)學，2006，26（12）：937.

[7] 張曉紅，張虎芳.兩種洗衣粉對泥鰍血清EST同工酶表達的影響[J].太原師范學院學報（自然科學版），2008，7（2）：162—164.

[8] 馬廣智，唐 玫，徐 軍，等.低pH對草魚鰓和肝組織超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響[J].中國水產科學，2001，8（1）：23—25.

[9] 李明云，黃福勇，竺俊全，等.大彈涂魚急性鎘中毒對脾臟4種同工酶表達的影響[J]. 海洋水產研究，2005，26（2）：36—40.

[10] 周宗漢，林金榜，朱婉華.介紹魚類組織中蛋白質及同功酶的電泳方法[J].淡水漁業(yè)，1983，14（2）：35—40.

[11] 季維智，宿 兵.遺傳多樣性研究的原理與方法[M].杭州：浙江科學技術出版社，1999.

[12] 靳曉敏，吳 垠，任 璐，等.兩種菊酯類農藥對鯉酯酶同工酶的影響[J].河北科技師范學院學報，2006，20（2）：33—36.

[13] 尹紹武，廖經球，黃 海，等.褐點石斑魚不同組織4種同工酶的研究[J].海洋通報，2007，26（1）：41—44.

[14] 賈秀英，董愛華.鉛對蟾蜍肝、腎過氧化物酶和酯酶同工酶的影響[J].生態(tài)學雜志，2005，24（2）：159—162.

[15] 王 蘭，楊秀清，王 茜，等.鎘在河蟹五種組織器官的積累及對酯酶同工酶的影響[J].動物學報，2001，47（專刊）：96—100.

[16] 牛紅星，王艷梅，余 燕.毛腿鼠耳蝠Myotis fimbriatus不同組織酯酶同工酶的比較[J].河南師范大學學報（自然科學版），2006，34（3）：143—145.