[摘要] 目的 研究RALYL在胃癌中的表達(dá)情況及其與臨床特征之間的關(guān)系。 方法 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化的方法對RALYL在胃癌中的表達(dá)情況進(jìn)行研究，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果 在胃腺癌和癌旁正常組織中，RALYL的mRNA水平和蛋白水平均有差異。免疫組化發(fā)現(xiàn)RALYL表達(dá)水平與腫瘤大小、T期、N期和M期有關(guān)，而與年齡和性別無關(guān)。 結(jié)論 RALYL在胃腺癌組織中的mRNA和蛋白水平表達(dá)均降低，其可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] RALYL；胃腺癌；表達(dá)

[中圖分類號] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）30-0063-03

The relationships between the expression of RALYL RNA binding protein-like and the gastric carcinoma

LI Weiming1 CUI Zhiwen2 YANG Zhenyu3

1.Department of General Surgery，Anyang County General Hospital，Anyang 455000，China；2.Department of General Surgery，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen 518000，China；3 Department of Cerebral Surgery，Anyang Sixth People’s Hospital，Anyang 455000，china

[Abstract] Objective To investigate the expression of RALYL in gastric carcinoma and the relationships between RALYL expression and clinical characteristic. Methods We used real-time quantitative PCR，immunohistochemical methods and statistical analysis methods to study the expression of RALYL in gastric carcinoma. Results Both in RALYL mRNA level and protein level， there are expression difference between the gastric carcinoma and normal paired gastric tissues. Immunohistochemistry analysis showed that RALYL protein expression in gastric carcinoma were significantly related with tumour size，T stage，N stage and M stage，while connections with age and gender were not found in gastric carcinoma. Conclusion RALYL’s mRNA level and protein level is decreased in gastric carcinoma，and it may be a new target for cancer therapy.

[Key words] RALYL；Gastric carcinoma；Expression

胃癌起源于胃壁表層的黏膜上皮細(xì)胞，可發(fā)生于胃的各個(gè)部位，其中胃竇幽門區(qū)最多，胃底賁門部其次。全球每年新發(fā)胃癌100余萬，死亡80余萬[1]，而中國是胃癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，發(fā)病率和死亡率均是世界平均水平的兩倍多。流行病學(xué)調(diào)查顯示，2007年我國前十位癌癥中，胃癌發(fā)病率為第二位，死亡率為第三位，男女之比為2∶1。胃癌的發(fā)病率隨著年齡的增加而顯著升高，發(fā)病高峰在50～80歲，胃癌有多種病理類型，其中胃腺癌占90%以上[2]。

近二十年來，胃癌的治療通過使用手術(shù)、放化療以及靶向治療等手段取得了巨大的進(jìn)展，但是效果依舊不如意。盡管發(fā)現(xiàn)飲食習(xí)慣[3，4]、環(huán)境、基因因素[5]與胃癌有關(guān)，但是胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制依舊不清楚。

RALYL屬于RALY亞家族，定位于8q21.2，其主要的功能為結(jié)合RNA和核酸。RALYL在正常的腎臟、腎上腺和大腦表達(dá)比較高，RALYL的表達(dá)降低和精神紊亂[6]、帕金森病[7]、腦腫瘤[8]、腎上腺腫瘤[9]和腎癌[10]有關(guān)。然而目前還沒有關(guān)于RALYL和胃腺癌臨床特征之間的報(bào)道。

本文從mRNA和蛋白水平分析RALYL在胃腺癌中的表達(dá)情況及RALYL的表達(dá)和臨床之間的關(guān)系，探討RALYL在胃腺癌中的診斷、治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

為了在mRNA水平檢測RALYL的表達(dá)，我們在2010年8月～2011年5月期間收集了在北京大學(xué)深圳醫(yī)院普外科手術(shù)切除的胃腺癌及癌旁正常組織37例。手術(shù)切除的新鮮組織立即放入含有RNA later（Invitrogen，US）的溶液中，4°C保存過夜，以使RNA later充分浸入到組織中，然后-80°C凍存。

另外，我們還收集了72例病理診斷明確的胃腺癌和癌旁正常組織石蠟組織塊（2003年9月～2009年1月期間在北京大學(xué)深圳醫(yī)院普外科手術(shù)切除），并收集了這些患者的相關(guān)臨床資料。相關(guān)資料見表1。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用TRIZOL試劑盒提取總RNA（Invitrogen，US），然后使用Omniscript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen，Germany）合成第一鏈的cDNA。合成第一鏈cDNA后使用Agilent2100 Bioanalyzer（Agilent technologies，US）來測量合成的第一鏈cDNA的濃度。

RALYL和內(nèi)參GAPDH的引物都用Primer 5軟件合成，RALYL上游引物為5’- GAGTCTAGTGCTGATCCAAG-3’，下游引物為5’-CCTCCTCTATCCCATCTGT -3’，內(nèi)參GAPDH的上游引物為5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3’，下游引物序列為5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC -3’。

使用Takara的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器是ABI7000，PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括1 μL cDNA，9 μL SYBR Green mix，上下游引物各0.8 μL，ROX 0.4 μL，雙蒸水8 μL、擴(kuò)增條件是95°C孵育2 min，然后95°C變性5 s，60°C退火30 s，68°C延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)完畢后收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 免疫組化分析及評價(jià)

對72例乳腺浸潤性癌和癌旁正常組織進(jìn)行免疫組化分析，所有的步驟均按照經(jīng)典的程序：首先進(jìn)行脫蠟和水化，將石蠟切片放在二甲苯溶液中浸泡20 min，重復(fù)1次，然后使用梯度濃度的乙醇（無水乙醇、95%、90%、85%、80%）浸泡，自來水沖洗，然后在微波爐中加熱，用枸櫞酸鈉緩沖液浸泡的組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS緩沖液沖洗后加入H2O2溶液滅活過氧化物酶活性，然后用非免疫性動物血清BSA 37°C進(jìn)行抗原封閉30 min，棄血清后加入RALYL抗體（Abcam，Britain，1∶200稀釋）50 μL，4°C過夜。最后經(jīng)PBS緩沖液沖洗之后，加入生物素標(biāo)記的二抗50 μL孵育30 min，再次經(jīng)PBS緩沖液沖洗后加入鏈霉菌抗生素過氧化物酶溶液孵育30 min后加入DAB溶液顯色，顯微鏡下觀察掌握染色程度，最后用蘇木素復(fù)染，自來水沖洗后脫水、透明、封片和鏡檢。

實(shí)驗(yàn)人員分別獨(dú)立地對這些免疫組化結(jié)果進(jìn)行了評價(jià)，采用的標(biāo)準(zhǔn)如下：根據(jù)細(xì)胞染色的比例進(jìn)行打分，0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。染色強(qiáng)度打分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞比例乘積得分分別為：0、1、2、3、4、6、8、9、12?！?分我們認(rèn)為RALYL蛋白表達(dá)降低，≥6分認(rèn)為蛋白表達(dá)升高[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；對免疫組化結(jié)果，RALYL蛋白表達(dá)和臨床特征之間關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR統(tǒng)計(jì)分析

對收集的37對胃腺癌和癌旁正常組織進(jìn)行中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果在31例胃腺癌組織中RALYL表達(dá)低于癌旁正常組織（t = 4.079，P < 0.01）。在胃腺癌和癌旁正常組織中RALYL表達(dá)差異有統(tǒng)學(xué)意義。

2.2 胃腺癌和癌旁正常組織的免疫組化分析

在正常的胃組織中，RALYL蛋白主要分布在上皮細(xì)胞的包漿和包膜上。72例胃腺癌中46例RALYL蛋白表達(dá)降低，而在癌旁正常組織中，只有31例RALYL表達(dá)較低，χ2=6.28，P = 0.012，在RALYL的蛋白水平，胃腺癌和癌旁正常組織表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 A圖 胃腺癌細(xì)胞免疫組化陰性（200×）；B圖 胃腺癌免疫組化強(qiáng)陽性（200×）；C圖 正常胃黏膜上皮細(xì)胞免疫組化強(qiáng)陽性（200×）

2.3 RALYL蛋白表達(dá)和臨床特征之間的關(guān)系

為探討RALYL蛋白在胃腺癌中的表達(dá)情況與臨床特征之間的關(guān)系，使用χ2檢驗(yàn)對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。72例胃腺癌中，46例RALYL蛋白表達(dá)降低（分?jǐn)?shù)≦4分），而表達(dá)升高的僅26例（分?jǐn)?shù)≥6分）。通過統(tǒng)計(jì)我們發(fā)現(xiàn)，胃腺癌中RALYL的表達(dá)水平和腫瘤大?。é?=5.131，P = 0.024）、T期（χ2=7.99，P = 0.018）、N期（χ2=11.372，P = 0.001）和M期（χ2=8.428，P = 0.004）有關(guān)，而與年齡（χ2=0.253，P = 0.615）和性別（χ2=2.346，P = 0.126）無關(guān)。見表1。

3 討論

目前我國人死因1/4為癌癥，而癌癥死因的1/4為胃癌，在消化系統(tǒng)的惡性腫瘤中，約半數(shù)死于胃癌[12-15]。當(dāng)前胃癌主要的治療手段是手術(shù)、放療、化療以及生物靶向治療等，但是不幸的是胃腺癌對放療的敏感性比較低。根據(jù)統(tǒng)計(jì)大約70%的胃癌患者早期無任何癥狀，等癥狀出現(xiàn)時(shí)，往往已經(jīng)是中晚期腫瘤，患者的治療療效與預(yù)后極差[13]。因此早發(fā)現(xiàn)是改善胃癌療效、提高生存率的關(guān)鍵[17]。

RALYL屬于RALY亞家族，其包括十個(gè)外顯子和一個(gè)能結(jié)合RNA的RRM（RNA結(jié)合模體）區(qū)域。RALYL在腎癌中表達(dá)降低并與預(yù)后相關(guān)，RALYL表達(dá)低的預(yù)后較差；且可能作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[18]；此外，RALYL還與腦腫瘤[11]、腎上腺腫瘤[12]有關(guān)。

本研究證明，與胃正常組織比較，在胃腺癌的mRNA水平和蛋白水平RALYL表達(dá)均降低，我們發(fā)現(xiàn)在RALYL表達(dá)與腫瘤大小、T期、N期和M期有關(guān)，而與性別和年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由于我們的研究是單一醫(yī)院的回顧性研究，不可預(yù)測的誤差可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，多中心多醫(yī)院的回顧性研究是必須的。所以為進(jìn)一步研究RALYL在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以及其能否作為診斷治療的靶標(biāo)，需要我們做更多的研究。

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（收稿日期：2012-08-06）