許靖詩 ，烏云塔娜 ，葉生晶，王 淋 , 馮延芝

梨種質資源SSR引物的篩選與評價

許靖詩a,b，烏云塔娜a,b，葉生晶a,b，王 淋a,b, 馮延芝a,b

（中南林業(yè)科技大學 a. 經濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；b.林學院,湖南 長沙 410004）

目前在梨種質研究中仍然缺乏足夠的SSR引物，因此篩選多態(tài)性豐富的SSR標記引物，為進一步研究梨種質資源的群體遺傳學特征等提供參考。運用SSR標記技術，從初選后的42對SSR引物中篩選出多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的引物。篩選出的12對引物對40個梨樣的DNA序列進行了SSR-PCR擴增, 共檢測出159個等位基因，平均每個位點檢測到13.25個等位基因;平均每個等位基因有效數(shù)目為1.236 4,平均I值為0.286 6，平均Nei指數(shù)值為0.165 3;系統(tǒng)聚類分析表明，所有樣品可以分為3個類群，即栽培梨、日本梨、野生秋子梨。篩選的12對多態(tài)性豐富的SSR引物適合用于梨種質資源群體遺傳學特征分析，為梨種質資源的收集、保存、鑒定、評價以及親緣關系研究提供方法和理論依據(jù)。

梨；種質資源；SSR分子標記；引物篩選

梨為薔薇科Rosaceae梨亞科Romoideae梨屬Pyrus多年生果樹，我國為梨屬植物的發(fā)祥地, 境內蘊藏著豐富的梨屬植物資源[1]，對其研究也較多[2-4]。研究梨的遺傳多樣性對了解不同梨類型起源、進化、種質收集利用與保存均具有重要意義。多年來，研究者從形態(tài)學、生物化學、孢粉學和酶學等不同的角度研究了梨屬植物的系統(tǒng)關系、品種起源和演化，取得了一定的進展。近年來，DNA標記技術的迅速發(fā)展為梨屬植物的系統(tǒng)關系等研究提供了新的手段，SSR標記在樹種的品種和親緣關系鑒定等方面也得到了廣泛應用。SSR（Simplesequence repeats，簡單重復序列）又稱微衛(wèi)星（Micro satellite DNA），主要是1～6個核苷酸的重復序列，廣泛存在于人類及動植物基因組中，因重復單位數(shù)目的差異形成了SSR位點上的多態(tài)性。與其他分子標記相比較，SSR具有以下優(yōu)點：①共顯性，能夠提供比顯性標記更多的信息；②位點豐富且隨機均勻地分布在整個基因組中；③以PCR為基礎，技術簡便，易于操作，重復性及穩(wěn)定性好。

近年來，國內外研究者利用SSR標記對梨屬植物有了一定研究。例如，2009 年Terakami［5］構建的Housui 遺傳圖譜，總長度117 4 cm，17個連鎖群、335個標記，其中105個SSR標記，224個AFLPs標記，分子標記之間的平均距離為3.5 cm。2007年曹玉芬等［6］利用12對SSR引物對41個梨品種進行擴增，獲得114個等位基因。Kimura等［7］通過9對SSR引物鑒別6個種的60個亞洲梨，其中7個SSR引物能將58個品種區(qū)分開。

雖然，SSR標記在梨的遺傳圖譜構建、種質多樣性分析、分子輔助育種以及品種鑒定等方面有所應用，但從梨屬植物基因組中開發(fā)出的SSR引物較少，檢測的SSR位點數(shù)不足以滿足品種鑒別和起源演化研究的需要，因而需要加快引物開發(fā)速度，同時擴大種以及品種的鑒定數(shù)量和范圍，為梨樹種的形成與演化、品種鑒別與遺傳多樣性分析以及親緣關系研究提供有效途徑。

本研究利用SSR標記，以40份梨為供試材料，篩選適合的多態(tài)性引物,為進一步研究梨種質資源的群體遺傳學特征、演化等提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗材料

供試材料包括：采集于鄭州果樹所的2份秋子梨栽培種、3份砂梨、3份白梨、4份新疆梨、5份西洋梨，采集于內蒙古的6份野生秋子梨，黑龍江的6份野生秋子梨、吉林的3份野生秋子梨；4份日本栽培梨，4份日本巖手山秋子梨（見表1）。采集后的新鮮葉片保存于-80℃冰箱備用。

表1 用于SSR分析的供試材料Table1 The tested materials of Pyrus by SSR analysis

1.1.2 實驗試劑

主要有：DNA提取試劑盒（購自TIANGEN）、CTAB、Tris、HCL、NaCl、NaOH、β-巰基乙醇、氯仿、異戊醇、乙二胺四乙酸二鈉、無水乙醇、瓊脂糖、尿素、硼酸、甲醛、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、無水碳酸鈉、冰乙酸、硝酸銀、過硫酸銨、四甲基乙二胺、甲酰胺、溴酚藍、二 甲 苯 胺、DNA Marker、dNTPs、PrimeSTAR DNA Polymerase。

1.1.3 主要儀器設備

主要儀器包括：離心機、離心管、研缽、旋轉式恒溫水浴鍋、液氮罐、移液管、微量移液器、1.5 mL和0.5 mL吸頭、電泳儀、水平電泳槽、成像凝膠系統(tǒng)、0.5 mL和1.5 mLEppendorf離心管、PCR儀、高壓滅菌鍋、電子天平、冰箱、穩(wěn)壓直流電泳儀、1 000 mL燒杯、玻璃棒。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物選擇

SSR引物序列由日本開發(fā)，基因組DNA的SSR引物由南京金斯瑞公司合成。

1.2.2 DNA提取與檢測

DNA 的提取按購自北京天根生物有限公司的植物DNA提取試劑盒(離心柱型)說明書進行,略作改動。提取的DNA在2﹪的瓊脂糖電泳檢測，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增

PCR反應在Bio-rad公司的擴增儀上進行。PCR反應體系采用正交設計優(yōu)化的方法,其中酶對PCR反應影響最大，引物次之，模板DNA影響最小[8]，最終反應體系見表2。PCR反應條件：（1）94°預變性3 min；（2）98°變性10 s；（3）60°退火5 s；（4）72°延伸 1 min；（5）返回（2），重復30個循環(huán)；（6）4°保存。

表2 PCR 擴增反應體系Table 2 PCR amplification reaction system

1.2.4 PCR產物的檢測

1.2.4.1 電泳 電泳步驟: (1) 制備4﹪ 聚丙烯酰胺變性凝膠; (2) 將0.5× TBE電極液放入電泳槽內；(3) 小心拔出梳子，將膠板裝入電泳槽內，1 200 V、150 mA、100 W預電泳30 min；(4) 擴增產物的變性：加入3×STR 5 mL, 95 ℃下變性5 min 后迅速用冰冷卻； (5)將梳子插入,用電極液沖洗上膠面；(6)點樣，點樣量為4 μL, MARKER為2 μL；(7) 200 V、150 mA、100 W電泳1.5 h。

1.2.4.2 銀染 銀染方法和步驟：（1）固定：電泳完畢后,卸下玻璃板,用薄鋼勺撬去未附有凝膠的玻璃板,將另一塊玻璃板以凝膠面朝上浸入1 000 mL體積分數(shù)為10﹪的冰醋酸溶液中輕微震蕩20 min。（2）水洗：將附有凝膠的玻璃板轉移到清水中輕微震蕩5 min,重復1次。(3)致敏：將附有凝膠的玻璃板轉移至用1 g AgNO3、1.5 mL 37﹪甲醛溶于1 000 mL H2O中配成的致敏液中輕微震蕩30 min。（4）水洗:以蒸餾水快速沖洗凝膠2次。（5）顯色：將玻璃板放入顯色液中,幾分鐘后即可見結果。顯色液為30 g無水Na2CO3、1.5 mL 37﹪甲醛、200 μL Na2S2O3·5H2O 溶于 1 000 mL H2O 中配成。（6）終止：將顯色后的凝膠分別放入第一步用過的冰醋酸以及清水中5 min。

1.2.5 SSR數(shù)據(jù)分析

各引物對應擴增出的等位基因依據(jù)分子量從大到小依次按1，2，3…進行編號。在相同遷移率位置上有帶記為1 和無帶記為0。在記錄過程中，統(tǒng)計主要帶型，忽略弱雜帶型，統(tǒng)計穩(wěn)定且易于分辨條帶，同時考慮品種間帶型的比對，構建SSR引物擴增結果的數(shù)據(jù)庫。

2 結果與分析

2.1 引物篩選

利用8份梨樣品對500對SSR引物進行初選，篩選出42個多態(tài)性好、帶型清晰的引物，占總引物數(shù)量的8.4﹪。利用40份梨樣品對初選的42對引物進行復選，共篩選出12對引物 (見表3) 。這些引物條帶清晰，多態(tài)性好，穩(wěn)定性好（見圖1、圖2），占總引物數(shù)量的2.4﹪，占初選引物的28.6﹪。12對引物覆蓋了梨的11條染色體，其中引物CH02e02和引物NH009b同時分布在同一條染色體上，其余引物均分布在不同染色體上（見表3）。

表3 12對引物名稱及序列Table 3 The name and sequence of 12 pairs of SSR primers

圖1 引物NH039在40個內蒙野生秋子梨中的部分擴增情況Fig.1 Amplification results of NH039a for 40 Inner Mongolia Pyrus ussuriensis

2.2 引物多態(tài)性分析

篩選出的12對SSR引物在40份梨樣中檢測到的159個等位基因，平均每對SSR引物檢測到13.25個等位基因。不同SSR引物檢測到等位基因數(shù)不等，其中引物NB105檢測到的等位基因數(shù)最多為24個，引物BGA35檢測到的等位基因數(shù)最少，僅7個。產生片段差異最大的引物為NB104a，PCR 產物片段長度從122 bp 到186 bp，產生片段差異最小的引物為BGA35，PCR 產物片段長度從120 bp 到 132 bp (見表 4) 。

表4 SSR引物擴增梨種質位點多樣性Table 4 Alleles diversity of different SSR primer amplified pear germplasm loci

圖2 引物CH03g06在40個內蒙野生秋子梨中的部分擴增情況Fig.2 Amplification results of CH03g06 for 40 Inner Mongolia Pyrus ussuriensis

2.3 SSR位點分析

利用12對引物對40份梨樣進行SSR檢測表明：各位點平均等位基因有效數(shù)分布在1.153 2～1.401 0之間，平均每個位點的等位基因有效數(shù)目為1.236 4，其中BGA35平均有效等位基因最多，NB105最少。Nei指數(shù)(h)則是假定某一特定位點上的兩個等位基因，根據(jù)各自的基因頻率來計算多樣性，分布范圍在0.251 9～0.122 5之間，平均每個位點的h值為0.165 3。I=1-ΣPi2，Pi為產物條帶的表型，根據(jù)擴增片段的有無確定產物條帶表型，平均每個位點的I值為0.286 6，I值最高的TsuENH155為0.408 9，I值最低的NB105為0.232 6 （見表 5） 。

表5 各位點基因的多樣性分析Table 5 Genetic diversity analysis of all locus

2.4 聚類樹的構建與分析

聚類樹建立的依據(jù)有2種, 其一是樣品之間的相似性系數(shù), 其二是樣品之間基因型的遺傳距離。本研究根據(jù)Nei’s遺傳距離，利用POPGENE32軟件構建遺傳關系UPGMA聚類圖（見圖3）。

由圖3可知，在遺傳距離為1.075時L12、L38等14個栽培梨可單獨聚為一類。在遺傳距離為2.448時，i2085、matuonashi等8個日本梨即可與Q53等15個野生秋子梨聚為兩類。同時日本梨可以分為兩個亞群，即matuonashii等4個日本栽培梨為一個亞群，i2085等4個日本野生秋子梨為另一個亞群。聚類分析的結果與樣品類型基本一致。由此表明所篩選出的SSR引物能有效區(qū)分不同類型，不同地區(qū)的梨種質資源。

圖3 建立在12個SSR指紋數(shù)據(jù)基礎上的40個梨樣聚類Fig.3 An UPGMA dendrogram of 40 samples based on 12 SSRS fingerprint

3 結論與討論

在本研究中，根據(jù)梨種質的花、果實、葉片等表型性狀和地理位置差異等選擇試驗材料，由此樣本篩選出的SSR引物對梨種質群體學研究等具有指導意義。本研究初選的42對SSR引物分布于梨的17條染色體上，覆蓋了梨基因組，篩選出的12對分布于梨11條染色體上的高多態(tài)性核心SSR引物，可以擴增出清晰的條帶。在聚類圖中栽培梨、中國野生秋子梨以及日本梨各自聚為一類，較客觀地反映群體結構和地域性差異等信息。在聚類分析中也出現(xiàn)了與群體結構不相符的現(xiàn)象：新疆梨L8單獨聚為一類，可能是由于采集的樣品L8可能為芽變品種；砂梨L1以及西洋梨L32與中國野生秋子梨聚為一類可能是由于實驗所檢測的多態(tài)性位點不夠充足, 尚不足以把所有供試品種完全區(qū)分開來，因而還需繼續(xù)開發(fā)新的引物。

2008 年張妤艷等［9］通過6對SSR引物對56份梨材料進行擴增檢測到40個等位基因，平均每個位點檢測到8個等位基因，而本研究平均每個位點檢測到13.25個等位基因。2011 年路娟等［10］利用25對SSR引物對6個分屬不同系統(tǒng)的160個梨資源進行多態(tài)性分析，共檢測到407個等位基因，聚類分析將所有材料分為西洋梨和東方梨兩大類。現(xiàn)在，SSR 分子標記技術日趨成熟，且簡便易行，運用該技術系統(tǒng)分析我國已有的梨屬種質資源，將成為未來發(fā)展的熱點[11]。

雖然SSR分子標記可應用于梨遺傳圖譜、品種鑒定等方面，然而，對于遺傳多樣性的研究由于芽變品種通常只涉及極少數(shù)位點的變異，芽變品種和原品種無法通過SSR標記得以區(qū)分，仍需要開發(fā)可揭示更多遺傳位點的SSR標記引物，或使用其他標記方法以提高對于芽變品種鑒別的效率。另外, SSR標記也存在不足,例如在判讀擴增條帶有無上受人為主觀因素影響較大, 不同的人判讀結果可能不一致, 因而如何減少人為因素的影響，是其改進的方向。

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SSR primer screening and assessment on pear germplasm resources

XU Jing-shia,b,WUYUN Ta-naa,b, YE Sheng-jinga,b, WANG Lina,b, FENG Yan-zhia,b
(a. Key Lab of Non-wood Forest Product of Forestry Ministry; b.School of Forestry , Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004,Hunan,China)

At present, the pear germplasm study lacks enough SSR primers, thus it is necessary to screened out SSR markers primer showing high polymorphismin and to further study the population genetic characteristics. The good polymorphism and high stability primers were selected out from the 42 pairs of SSR primers by SSR molecular primer. The 40 pear samples’ DNA sequence were amplified with 12 pairs of SSR primers by SSR-PCR technique, 159 alleles were detected, on average, 13.25 alleles were detected from per site. Each alleles effective number was 1.236 4, and the average I value was 0.286 6, the h value was 0.165 3. The system clustering analysis showed that all the samples can be divided into three groups: cultivation pear, the Japanese pear, Pyrus ussuriensis Maxim in China. The screened 12 pairs of polymorphic SSR primers were suitable for studying on collection, preservation, identification,evaluation and genetic relationship of pear germplasm resources.

pear; germplasm resources；SSR molecular markers; primer screening

S722.3; S661.2

A

1673-923X (2012)07-0080-06

2012-04-10

國家自然科學基金（編號：31000309）

許靖詩(1987—),女,四川省樂山市人,碩士研究生,研究方向為經濟林栽培育種;E-mail:xujingshi870201@126.com

烏云塔娜（1975—），女，內蒙古通遼人，教授，博士， 主要從事經濟林育種與栽培的研究；E-mail:tanatana@sina.com

[本文編校：謝榮秀]